水體中葉綠素α測定方法的探究

李會玲，趙鋒，豆艷霞

分析測試

水體中葉綠素α測定方法的探究

李會玲，趙鋒，豆艷霞

（安康市環境保護監測站，陜西安康725000）

在環境監測中，葉綠素α的測定方法主要參照《水和廢水監測分析方法》（第四版）中的分光光度法，該方法存在測定結果誤差大的問題，同時暴露在高濃度丙酮環境中，對分析者的健康有損害影響。在原始方法的基礎上進行了免研磨法提取葉綠素α，實驗結果表明：該方法對葉綠素α提取率的提高率可達53.4%～62.8%，有效避免了研磨過程造成的葉綠素α損失，同時發現隨著提取時間的增加，葉綠素α的測定值增加，且提取8 h后增長的趨勢開始趨于穩定。

葉綠素α；免研磨法提取；提取率

葉綠素α是植物光合作用中的重要光合色素。通過測定浮游植物葉綠素α，可掌握水體的初級生產力情況[1]。在環境監測中，可將葉綠素含量作為湖泊富營養化的重要指標之一[2-3]。美、日等發達國家對葉綠素α的測定已列入了標準分析方法，其中的測定方法包含了分光光度法，熒光法和高效液相色譜法[4]。目前，我國對葉綠素α的測定尚無國家標準，分析方法主要參考《環境監測技術規范》、《湖泊富營養化調查規范》和《水和廢水監測分析方法》中的分光光度法[5]。

目前，水質監測工作中常用的方法是參照《水和廢水監測分析方法》（第四版），但我們在實驗過程中發現，研磨等多次轉移操作會大大降低葉綠素α的提取率，導致測定結果誤差，同時丙酮是一種極易揮發的有毒的有機溶劑，研磨過程中接觸90%的高濃度丙酮，對人體健康造成很大的損害。鑒于以上問題，本文對第四版書中葉綠素α測定方法進行了簡化改進，以期提高葉綠素α的提取率和穩定性，確保實驗結果的準確度。

1 材料與方法

1.1 水樣的采集

在發生富營養化的某庫區（1#），庫區上游未受污染段（2#），庫區下游段（3#）3個采樣點分別采集水樣500 mL，低溫（0℃～4℃）避光保存，次日測定。

1.2 水樣的處理

水樣的濃縮：裝好抽濾裝置，在抽濾器上裝好醋酸纖維濾膜，過濾前在濾膜上加入少量的碳酸鎂懸浮液（碳酸鎂懸浮液成弱堿性，可以保護葉綠素防止酸化引起色素溶解），水樣抽完后，繼續抽1～2 min；提取：抽濾完成后，將帶有樣品的濾膜迅速對折成條狀放入10 mL的玻璃比色管中，加入10 mL的90%丙酮后立即蓋好蓋子，用力上下振蕩1 min，然后在黑暗中靜置，提取時間分別設定為0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h（期間0．5 h震蕩一次，以保證提取完全）；離心：靜置提取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后將試樣倒入10 mL的離心管中，用離心機（3000～4000 r/min）離心10 min。將上清液倒入10 mL容量瓶中，用丙酮定容，搖勻。

1.3 測定

將上清液倒入1 cm光程的比色皿中，放入紫外分光光度計中比色，在分別放置0 min、5 min、10 min、20 min、30 min后，讀取750 nm663 nm645 nm630 nm波長的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度測定，對樣品吸光度進行校正。

1.4 對照試驗

在進行上述改進操作的同時，按照原始研磨測定方法（按《水和廢水監測分析方法》中的操作），設置了對照實驗。

2 結果與討論

2.1 提取時間對實驗結果的影響

從三個點位（1#富營養化某庫區，2#未受污染的上游段，3#污染的下游段）采集的水樣，按照上述材料與方法部分的操作，在提取步驟，靜置提取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后分別取定容后的上清液測定吸光度，得到的提取時間對測定結果的影響見圖1。由圖1可知，同一提取時間條件下，富營養化庫區中葉綠素α值最高，達2.7～12.9 mg/L，高于上游未受污染段水體的1.85～2.00倍，污染區的下游段葉綠素α為1.53～7.23 mg/L。從圖1還可以看出：隨著靜置提取時間的增大，葉綠素α的測定值增加，表明葉綠素α的提取率增加，在靜置提取約8 h后增長的趨勢開始趨于穩定。因此，為了保證測定結果的準確，要控制好提取靜置時間，以充分提取出水體中的葉綠素α。 2.2本實驗方法與原始方法測定值的對比

圖2為本實驗中的改進方法中靜置提取8 h后的測定值，與原始的操作方法（低溫干燥8 h后再研磨提取）的測定值的比較。由圖2可知，在該方法的操作條件下，同一水樣葉綠素α的測定值增加了53.4%～62.8%，可見，該方法大大提高了葉綠素α的提取率，避免了研磨過程造成的損失。

圖1 提取時間對測定值的影響

圖2 兩種測定方法的比較

2.3 測定時間對測定值的影響

按照材料與方法中的操作方法，樣品離心提取后，分別在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min時測定其吸光度，測定值如圖3所示。由圖3可知，離心后的提取液放置的時間會對測定值造成影響：5 min以內影響不會太大；15 min以內有一定的影響；25 min以后影響比較大。可能是放置時間過長，引起色素分解造成的。因此，在測定離心提取液時要及時，防止因放置時間過長造成測量值偏低。

圖3 測定時間對測定結果的影響

3 結論

（1）如果不是馬上測量，水樣需進行預處理，采集的水樣加入碳酸鎂懸濁液，（每升水樣加1%碳酸鎂懸濁液1 mL），以防止酸化引起色素溶解。

（2）為了使色素得到充分的提取，要對提取液進行充分多次振蕩，要把提取時間控制在8～10 h之內，這樣才能保證較高的提取效率，但不能無限制地延長提取時間，以防止色素分解。

（3）本實驗的方法對葉綠素α的測定值提高了53.4%～62.8%，有效避免了研磨過程造成的葉綠素α損失。

（4）在測量吸光度時，應在5 min內迅速測量完畢，以防止色素分解，引起結果偏低。

[1]吳姝英.葉綠素α測定方法之比較[J].福建水產，2011，33（4）:61-63.

[2]國家環保局.水生生物監測手冊[M].南京：東南大學出版社，1993:177-178.

[3]李勝生，董元華，劉云，等.微囊藻中提取方法的優化[J].環境監測管理與技術，2008，20（4）:43-45.

[4]劉樞.水體中葉綠素a測定方法探討[J].農業與技術，2012，32（10）:9，36.

[5]金相燦，屠清瑛.湖泊富營養化調查規范[M].北京：中國環境科學出版社，1990:286-302.

[6]國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法[M].第4版.北京:中國環境科學出版社，2002:670-672.

An Exploration for the Determination of Chlorophyll α in Water

LI Hui-ling，ZHAO Feng，DOU Yan-xia
（Environmental Monitoring Station of Ankang，Ankang，Shaanxi 725000，China）

The determination of chlorophyll α according to The Water and Wastewater Monitoring Analysis Method（the fourth edition）was used widely in environmental monitoring，there existed a biggest disadvantage of determinate error，another disadvantage is that it’s harmful to analysts who exposed to an analysis environment with high concentration of acetone.The method used in this paper was preferable due to avoiding grinding where a greater loss come about.The results showed that compared with the extraction efficiency under traditional method above，the extraction efficiency under this method increased by 53.4%～62.8%.The results also revealed that measured value increased with the growth of extraction time，and was tending towards stability after 8 hours.

chlorophyll α；extraction avoided grinding；extraction efficiency

1006-4184（2017）3-00052-03

2016-05-25

李會玲（1973-），女，陜西安康人，本科，工程師，研究方向：環境監測與分析。E-mail:846888501@qq.com。