水稻紋枯病拮抗菌的篩選、鑒定及抑菌活性測(cè)定

彭 迪，朱哲遠(yuǎn),2，李祖任,2，王立峰，劉 洋，柏連陽,2

（1.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省水稻研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染水稻所形成，世界各產(chǎn)稻國(guó)家均有分布，亞洲稻區(qū)危害最為嚴(yán)重，水稻感染后品質(zhì)出現(xiàn)明顯下降，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致絕收[1-2]。該病被歸為土傳病害，立枯絲核菌等病原菌形態(tài)以菌絲或菌核在土壤中越冬，待溫度、濕度等條件適宜時(shí)會(huì)大量生長(zhǎng)，在水稻生長(zhǎng)中后期隨著田間氮肥的過量單一使用，水稻抗病性的降低，病原菌導(dǎo)致水稻感病，從而紋枯病流行爆發(fā)[3-4]。解決水稻紋枯病的根本措施是選育抗病品種，但目前還未能篩選到高抗或免疫品種，主要還是通過井岡霉素等化學(xué)藥劑來防治[5-6]。由于化學(xué)藥劑的使用存在農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等諸多弊端，加上我國(guó)積極推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展，提倡實(shí)施高效綠色防控措施，因此結(jié)合生物防治進(jìn)行綜合防治的方式成為當(dāng)今水稻紋枯病研究熱點(diǎn)。

拮抗微生物可作為生物防治材料控制水稻紋枯病的發(fā)生，近年已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抗紋枯病的拮抗真菌、細(xì)菌和放線菌[7-10]。芽孢桿菌（Bacillus spp.）是當(dāng)前研究較廣、應(yīng)用較多的生防菌，它們?cè)谏L(zhǎng)過程中產(chǎn)生了多種抗菌化合物。Wichitra等報(bào)道，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NSRS 89-24中提取的β-1,3-葡聚糖酶和抗生素能夠降解紋枯病原菌等真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁，控制病害的發(fā)生[11-13]。盧鈺升等[14]從水稻土壤中分離的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GB58，與常規(guī)藥劑對(duì)比對(duì)水稻紋枯病防效提高了24%。游景茂[15]分離的枯草芽孢桿菌WJ-1，能在抑制菌絲生長(zhǎng)同時(shí)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)畸形、潰解和內(nèi)部物質(zhì)泄漏。陳劉軍等[16]分離的蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cerens）AR156對(duì)水稻紋枯病溫室防效達(dá)到73.06%，同時(shí)促進(jìn)水稻生物量增加了14.45%。因此，篩選出抑制病原菌和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌是植物病害防治的重要方向。

為篩選出對(duì)水稻紋枯病菌的高效拮抗生防菌，湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室從野外采集并分離細(xì)菌菌株，采用劃線對(duì)峙方法篩選出對(duì)水稻紋枯病病菌有抑制作用的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）B-2，采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定菌株對(duì)紋枯病菌的室內(nèi)抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株 待篩菌株為實(shí)驗(yàn)室從野外從不同水稻病健植株分離到的細(xì)菌菌株，按1∶1與甘油混合存于-20℃冰箱中。靶標(biāo)菌株為實(shí)驗(yàn)室從野外感染水稻紋枯病的水稻葉片表面采集、分離和鑒定的水稻紋枯菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌培養(yǎng)基采用LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，定容至1 000 mL，pH值7.0，用于生防細(xì)菌的發(fā)酵。真菌、生防平板試驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，定容至1 000 mL，pH值7.0。

1.2 待篩選菌株發(fā)酵液制備

將待篩選菌株按0.5%的量接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下按200 r/min置于恒溫?fù)u床中，振蕩培養(yǎng)40 h，得到菌種發(fā)酵液。

1.3 拮抗菌篩選

采用劃線對(duì)峙法篩選對(duì)水稻紋枯病菌有生長(zhǎng)抑制的細(xì)菌菌種，用接種環(huán)沾取待篩細(xì)菌菌株發(fā)酵液1環(huán)于已凝固的PDA平板中央劃線，劃線方式：從平板中央上邊緣垂直劃一條直線到下邊緣。距離中央菌液直線中點(diǎn)左右各6 cm處分別接種水稻紋枯病菌菌碟，設(shè)置3個(gè)重復(fù)和空白對(duì)照，空白對(duì)照不劃待篩菌株線。在25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待空白對(duì)照左右菌碟菌絲生長(zhǎng)相交，測(cè)量水稻紋枯病菌邊緣和待篩菌株直線之間抑菌帶寬度，篩選出對(duì)水稻紋枯病菌抑制效果最好的細(xì)菌菌株。

1.4 拮抗菌抑菌活性測(cè)定

根據(jù)劃線對(duì)峙法篩選的結(jié)果，選擇對(duì)水稻紋枯病菌抑菌效果最好的細(xì)菌菌種，采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定細(xì)菌菌株的抑菌活性，按照1.2中方法制備細(xì)菌菌株發(fā)酵液[17]。將活化好的水稻紋枯病菌接種于PDA平板中央，滅菌鑷子夾取6 mm無菌濾紙片放置于與中心等距的左右兩方。用移液槍吸取10 μL細(xì)菌菌株發(fā)酵液到濾紙片中央，設(shè)置3個(gè)重復(fù)和空白對(duì)照。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈半徑（濾紙片圓心到中央靶標(biāo)菌盤最邊緣菌絲距離）觀察抑菌效果。根據(jù)公式（1）計(jì)算抑菌活性。

1.5 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA通用引物對(duì)細(xì)菌B-2的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定和BLAST比對(duì)[18]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由擎科生物技術(shù)有限公司提供并進(jìn)行序列測(cè)定，同源性搜索比對(duì)使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.6 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻紋枯病的田間防治效果

試驗(yàn)地位于長(zhǎng)沙縣高橋鎮(zhèn)，試驗(yàn)田為紋枯病發(fā)病較嚴(yán)重的水稻田，水稻品種為農(nóng)香32。2017年田間試驗(yàn)包括4個(gè)處理：拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（含菌量為1×108CFU/mL）；拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（含菌量為5×108CFU/mL）；藥劑對(duì)照生物農(nóng)藥井岡霉素wp；清水對(duì)照。每處理重復(fù)4次，共16個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為30 m2（6 m×5 m）。各小區(qū)按隨機(jī)區(qū)組排列。水稻分蘗末期施藥1次，對(duì)水750 g/hm2噴霧，至水稻抽穗初期施用第2次，間隔10 d后在水稻齊穗期第3次用藥。

調(diào)查方法：第3次用藥后14 d分別調(diào)查各小區(qū)的發(fā)病情況。每小區(qū)調(diào)查200株，記載發(fā)病株和嚴(yán)重度（計(jì)算病株率、病情指數(shù)和防治效果）。調(diào)查方法按照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》（一）進(jìn)行，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級(jí)：全株無病；1級(jí)：第四葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病（以劍葉為第一片葉）；3級(jí)：第三葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；5級(jí)：第二葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；7級(jí)：劍葉葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；9級(jí)：全株發(fā)病，提早枯死。

采用鄧肯氏新復(fù)極差（DMRT）法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選結(jié)果

從野外水稻田采集、分離和純培養(yǎng)得到5株細(xì)菌菌株，以水稻紋枯病菌作為靶標(biāo)指示菌，篩選出有拮抗作用的菌株，其中B-2拮抗效果最好，水稻紋枯病菌外圍與中央生防菌株線形成空白區(qū)域最廣。

2.2 拮抗菌活性測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)PDA平板對(duì)峙培養(yǎng)30 h后，B-2菌株對(duì)水稻紋枯病菌的平均抑菌圈半徑為1.6 cm（圖1），未加入拮抗菌種的對(duì)照處理平均抑菌圈半徑為0 cm。處理組與對(duì)照組差異較為明顯，B-2抑菌活性為85.33%，表明B-2菌株對(duì)水稻紋枯病菌有較明顯的抑制效果。

2.3 拮抗菌鑒定結(jié)果

通過分子生物學(xué)的方法，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和公司的測(cè)序，將16S rDNA序列提交至NCBI中，用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公開的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明菌株B-2為短小芽孢桿菌。

2.4 拮抗菌B-2防治水稻紋枯田間防治效果

田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），短小芽孢桿菌B-2對(duì)紋枯病的防治效果較好，相對(duì)于清水對(duì)照處理，其他3個(gè)處理的水稻紋枯病的發(fā)病率都有明顯的降低，其中5×108CFU/mL濃度的B-2菌懸液處理的發(fā)病率最低，對(duì)紋枯病的防效達(dá)到了72.42%。

圖1 拮抗菌B-2對(duì)水稻紋枯病菌抑制效果

表1 短小芽孢桿菌B-2防治紋枯病田間試驗(yàn)效果

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，B-2在室內(nèi)平板試驗(yàn)中對(duì)水稻紋枯病菌的拮抗抑制作用明顯。試驗(yàn)中采取劃線對(duì)峙法篩選拮抗菌種，通過觀察菌株之間空白區(qū)域面積，初步判斷生防菌株對(duì)靶標(biāo)菌株的拮抗作用，借鑒藥敏實(shí)驗(yàn)采取的紙片擴(kuò)散法進(jìn)一步測(cè)定菌株的抑菌活性，這種方法相對(duì)其他篩選、鑒定方法快速、方便且準(zhǔn)確。

在植物生物防治中，分離的生防菌一般具有對(duì)病原菌有拮抗作用外，還對(duì)植物具有一定的促生作用[19]。馬桂珍等[20]從海洋中分離了細(xì)菌L1-9對(duì)小麥根腐葉枯病和小麥赤霉病有良好的防病效果，同時(shí)能顯著提高小麥種子的發(fā)芽率和小麥的株高，促進(jìn)小麥生長(zhǎng)。田大偉等[21]研究的促生芽孢桿菌OKB105、FZB42在防治水稻白葉枯病同時(shí)使水稻株高增長(zhǎng)15.86%，產(chǎn)量提升14%。分離的拮抗菌株B-2經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌，對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果明顯，對(duì)水稻生長(zhǎng)的促生作用還待驗(yàn)證，拮抗菌生長(zhǎng)產(chǎn)生激素類物質(zhì)是促進(jìn)作物生長(zhǎng)的原因之一，可預(yù)期估計(jì)B-2對(duì)水稻生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。

試驗(yàn)中分離的短小芽孢桿菌B-2對(duì)水稻紋枯病菌抑制活性高達(dá)85.33%，可作為生物防治的有效措施之一，也可作為生物農(nóng)藥開發(fā)的重要菌株。開展B-2的分子生物學(xué)研究，找到相關(guān)功能基因，分析功能基因的作用機(jī)制，研究相關(guān)的代謝通路表達(dá)等，可以為進(jìn)一步改造出發(fā)菌株，使其在大田生防中表現(xiàn)出更良好的防效。通過目前的試驗(yàn)，已經(jīng)表明B-2有很好的生防應(yīng)用前景，實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)一步開展田間生防試驗(yàn)和菌株基因功能挖掘。

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