克氏原螯蝦消化道一種新型抗菌物質的分離與鑒定

黃暢+高建軍

摘要：克氏原螯蝦（Procambarus clarkii ）俗稱口味蝦，是我國南方的著名食用蝦，也是目前全世界養殖范圍最廣的淡水螯蝦。我們選擇活體克氏原螯蝦腸道組織為材料，經過超聲破碎、高效液相色譜分離、質譜和光譜分析、抗菌活性檢測。發現螯蝦腸道含有一種相對分子質量為245.17的新型化合物PC245，其最大吸收波長237nm，同時對嗜水氣單孢菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌作用。實驗結果表明：該抗菌活性物質是一種廣譜、高效的新型抗菌天然產物，

具有潛在的開發利用價值。

關鍵詞：克氏原螯蝦；消化道；抑菌活性；分離；鑒定

人類為了預防、治療微生物引起的疾病傳播，發明了多種有效抗菌物質，并將它們添加到食品、日用品和保健品中，其中使用最廣泛的就是抗生素。然而由于抗生素類藥物的大量長期使用，導致了耐藥細菌甚至超級細菌的出現，給動植物細菌病的防治帶來了嚴重的挑戰[1]。因此開發新的抗菌藥物，突破抗生素耐藥性難題，已經成為當今世界關注的焦點和研究的熱點。

從動植物和微生物中提取天然抗菌活性物質是尋找新型抗菌藥物的重要途徑，因為天然抗菌活性物質具有高效、低毒、無污染和來源廣等特點，可以有效抑制細菌的生長，同時也不會對環境造成污染，產生抗藥性[2]。

克氏原螯蝦屬甲殼綱，十足目，蝲蛄科，螯蝦亞科，原螯蝦屬，體黑紅色；原產于美國、墨西哥以及古巴的淡水中[3]。日本在1918年作為牛蛙餌料從美國引入，1929年從日本引入我國南京地區，現主要分布于長江中下游各水域，并成為我國淡水蝦類養殖的一種重要資源；同時又是生態競爭優勢而導致破壞性危害的外來物種[4]。螯蝦可以在滿布細菌、比較骯臟、受污染的水體中生活，同時靠水中腐敗的植物和動物尸體為食的獨特食性，這為研究抗菌肽的多樣性和適應性提供了理想的材料，本文以克氏原螯蝦為材料，從消化道分泌物中分離新型抗菌活性化合物，并對其結構和抑菌活性進行研究。

1 材料

1.1 材料。克氏原螯蝦從湖南岳陽鄉下購得。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由中南林業科技大學提供。

1.2 試劑與儀器。三氟乙酸（TFA），Sigma 公司生產；乙腈，Merck公司生產；HCCA（-氰基- 4-羥基肉桂酸） ，美國ICN 生物醫學公司生產；高效液相色譜儀（Alliance 2695與1525），美國Waters公司；C- 18色譜柱（250mm×20.00mm和250mm×4.60mm），美國菲羅門公司；質譜儀（MALDI- TOF/ TOF），德國Bruker公司；高速冷凍離心機（5804R），美國Eppendorf公司；高壓滅菌鍋（HVE- 50）美國HIRAYAMA公司。

1.3 培養基。LB液體培養基： 稱取LB固體培養基1.8 g溶于100 mL蒸餾水中，煮沸至完全溶解，分裝于試管，121℃高壓滅菌20 min，備用。

MH固體培養基（MH瓊脂平板） ： 稱取Mueller- Hinton瓊脂（MHA） 3.8 g溶于100 mL蒸餾水中，煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至55℃傾注平板，備用。

2 方法

2.1 螯蝦腸道抗菌活性物質提取。選擇新鮮的克氏原螯蝦，在蝦頭部剪一個口子，然后從該開口處沿蝦背部剪開至蝦尾，得到蝦腸，清除脂肪、腸道內容物后剪碎。先用組織搗碎機搗碎，再用超聲波細胞粉碎機破碎10次，每次3s。加入超純水4℃攪拌過夜。次日將混合物于4℃、8000r/min離心30min，取上清液冷凍干燥即為抗菌活性物質粗提物。

2.2 反相高效液相色譜純化。第一次反相色譜純化在配備1525泵和2487雙波長檢測器的高效液相色譜系統上進行；收集各洗脫峰，并經冷凍干燥后，保存備用。目的組分第二次反相色譜純化在配備2489雙波長檢測器的Alliance 2695系統上進行；流動相采用二元梯度：A液含0.1%三氟乙酸水溶液，B液含0.1%三氟乙酸的乙腈；檢測波長為280nm與215nm雙波長；柱溫箱為35℃；分析型C- 18色譜柱為（250mm×4.60mm美國菲羅門公司的Lunar柱）。洗脫梯度見表1。

2.3 質譜分析。質譜分析在Bruker公司Micro- TOF QII上進行。對篩選得到的目標樣品用50%蒸餾水與50%的乙腈溶解后，加入0.1%的甲酸混勻，進樣；霧化氣為氮氣，正離子模式下測定目標組分的相對分子質量。

2.4光譜分析。在日立UV2300紫外/可見分光光度儀上進行。波長范圍：200～1100nm；掃描速度：100nm/min；自動切換波長為340nm。將篩選得到的樣品體積100L進行全波長掃描，測定目標組分的吸收波長。

2.5 抑菌活性分析。采用紙片擴散法測定抑菌效果。將試驗菌復蘇，按0.1%的接種量搖菌培養14- 16h；然后按每平板100- 200 L均勻涂布于營養瓊脂平板（ 9 cm），待稍干后貼上無菌濾紙片（6 mm），在各個濾紙片上分別滴加10、20、30、40L各洗脫峰凍干樣品（40 mg/ml）；同時設置滴加無菌生理鹽水（20 L）為空白對照；4℃靜置3h，37℃恒溫培養24 h，測定抑菌圈的大小，以判斷目標樣品的抑菌效果。

3 結果與分析

3.1螯蝦腸道組織樣品制備。螯蝦腸道組織經超聲波破碎提取后，離心并取上清冷凍干燥，粗提樣品為淡黃色粘稠狀的固態物質。粗提樣品的檢測、純化、活性分析，每次用50ml蒸餾水溶解，0.22μm針式過濾頭過濾后待用。

3.2反相高效液相色譜純化。螯蝦腸道組織粗提樣品經HPLC分離，在280nm和215nm雙波長檢測條件下，螯蝦腸道組織粗提樣品得到10個比較大的吸收峰，其中保留時間最短為4.75分鐘，最長為30.42分鐘。抑菌試驗篩查實驗顯示色譜純化中保留時間為4.75分鐘的洗脫峰對嗜水氣單孢菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具明顯的抑菌效果。因此，選擇該洗脫峰作為目標組分進行二次純化（見圖1）。

從圖1可看到帶星號的洗脫主峰是目標峰，旁邊還有幾個小峰，洗脫溶液無色透明，說明目標組分通過二次純化后變得更純了。

3.3 質譜分析。目標組分經質譜分析結果見圖2。從圖可知：目標組分主峰的相對分子質量為246.17（M+H+），據此，將該樣品組分命名為PC245；同時，質譜分析圖上沒有出現其它較大的分子離子峰，說明二次反相純化后，目標組分樣品非常純。

3.4光譜分析。目標組分經UV2300紫外/可見分光光度儀分析結果見圖3。從圖3可知：目標組分在237 nm波長處有最大吸收峰，峰值為0.419。

3.5抑菌活性測定。將目標組分PC245對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌的抑菌實驗數據進行統計，見圖4、圖5、圖6的抑菌效果。

圖4 PC245對大腸桿菌的抑制作用

圖4沿順時針方向滴加樣品體積數分別為10、20、30、40 μL，平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

圖5沿順時針方向滴加樣品體積數分別為10、20、30、40μL，平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

圖6沿逆時針方向滴加樣品體積數分別為10、20、30、40 μL。平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

從圖4、5、6可看到：在濾紙片的周圍出現透明抑菌圈，且抑菌圈的大小隨樣品體積的增加而增大，說明有量、效關系；同時也可看到PC245對嗜水氣單胞菌的抑菌圈比大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的更大、更清晰、更透明，說明PC245對嗜水氣單胞菌的抑菌效果更好。

4 討論

提取天然抗菌活性物質來防治細菌病已經成為動植物抗菌制劑開發的新趨勢。從克氏原螯蝦消化道提取抗菌活性物質是找尋抗菌活性化合物的一種新思路[5]。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單孢菌是三種常見的致病菌，其中嗜水氣單胞菌廣泛存在于水體環境中，是造成淡水蝦、魚類出現敗血癥的病原菌[6]。

本項目將從活體克氏原螯蝦獲得的腸道組織進行超聲破碎提取，經高效液相色譜分離純化，得到一種新型化合物PC245；紫外/可見分光光度掃描顯示PC245在237nm波長處的紫外區具最大吸收波長，分子量比較小，親水性強，推測是一種小分子有機化合物；抑菌實驗證明PC245對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單孢菌均具有抑制效果，而且在相同濃度下，PC245對嗜水氣單孢菌抑制作用更明顯，但是PC245的化學結構還需進一步確認，其完整生物學活性也有待更深入的研究。

參考文獻

[1] 馬蘇，高艷美.動物源細菌耐藥性對動物細菌傳染性疾病防治的影響[J].中國獸藥雜志， 2012，（2）：50-52.

[2] 操慶國，國欽，黃敏等.天然抗菌物質研究進展[J].保鮮與加工.，2006，（3）：10-12.

[3] 王順昌.克氏螯蝦的生物學和生態養殖模式[J].淡水漁業， 2003， 33（4）： 59-61.

[4]徐加濤等.克氏原螯蝦產業發展背景、現狀與展望[J].水產科技情報，2011，38（4）：172-180.

[5] 蘇建明等.草魚腸道抗菌肽的提取及體外抑菌效果初步研究[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版）.2009，35（2）：162-165.

[6] 劉振興等.嗜水氣單胞菌對克氏原螯蝦免疫相關因子活性的影響[J].華中農業大學學報， 2011， 30（3）： 358～363.