紫草素誘導細胞凋亡及凋亡信號途徑研究進展

謝羽 侯小龍 伍春蓮

摘要：細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是指細胞為維持內環境穩態由基因控制的自主有序性死亡。細胞凋亡主要通過內質網、線粒體和死亡受體3種途徑介導。紫草素是一類萘醌類化合物，為中藥紫草的主要有效成分之一，具有多種生理活性，其抗腫瘤功效是目前研究熱點。紫草素抗腫瘤機制與3種細胞凋亡信號途徑密切相關。本文就紫草素誘導細胞凋亡及細胞凋亡信號途徑的研究進展作一綜述。

關鍵詞：紫草素；細胞凋亡；信號途徑；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.031

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）03-0125-05

Research Progress in Cell Apoptosis Induced by Shikonin and Signal Pathway of Apoptosis XIE Yu， HOU Xiao-long， WU Chun-lian （College of Life Science of China West Normal University， Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation of Ministry of Education， Nanchong， 637009， China）

Abstracts： Apoptosis， also known as programmed cell death， is a gene controlled active cell suicide process in order to maintain balance of organisms. Apoptosis is mainly mediated through three signal pathways， including the endoplasmic reticulum， mitochondria， and death receptor. As a kind of naphthoquinone compounds and one of the main active ingredients of Lithospermum， shikonin has many biological activities， and its anti-cancer research is recent hot spot. The anti-cancer mechanism of shikonin is closely related with apoptosis and three kinds of signaling pathways. This article reviewed the research progress in apoptosis and signal pathways induced by shikonin.

Key words： shikonin； apoptosis； signal pathway； review

紫草Arnebiae Radix為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst.或內蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根。紫草素是一類萘醌類化合物，為紫草的主要有效成分之一，具有抗病毒[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、加速傷口愈合和增強免疫[4]等功效。其中紫草素的抗腫瘤作用是目前研究的熱點，而該作用主要通過誘導細胞凋亡實現。本文就紫草素誘導細胞凋亡的生物學功能及細胞凋亡的信號途徑作一綜述。

1 細胞凋亡

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是由基因決定的自主性的細胞死亡過程。細胞凋亡與生物的多種生命活動都有著十分密切的聯系。細胞凋亡異常會導致腫瘤的發生。細胞凋亡與腫瘤的治療有著密切的聯系[5]，多種化療藥物的作用機理都與誘導細胞凋亡有關[6]。

基金項目：中國博士后科學基金（2013M540391）；四川省教育廳重大培育項目（13CZ0029）；三峽庫區生態環境與生物資源省部共建重點實驗室開放課題基金項目（SKL-2011-05）

通訊作者：伍春蓮，E-mail：wcl_xj@163.com

細胞發生凋亡時會伴隨相應的分子和細胞結構水平的變化，如DNA的降解，相關蛋白和酶的異常表達，并伴Ca2+的釋放，還伴隨有細胞膜、線粒體膜通透性改變以及細胞骨架松散等現象[7]。

2 紫草素誘導的細胞凋亡

自1999年Hashimoto發表β羥基異酰紫草素抑制多種癌細胞的生長并誘導白血病HL60細胞凋亡研究報告以來，出現大量紫草素誘導細胞凋亡相關研究成果。Gao D等[8]通過電子旋轉發現紫草素能與谷胱甘肽和其他氧化脅迫相關的復合物相互作用，最終誘導HL60細胞凋亡。Hou Y等[9]采用MTT比色法和流式細胞技術研究發現，紫草素可體外誘導MCF-7細胞凋亡。Calonghi N等[10]發現紫草素可通過抑制細胞外表皮生長因子受體誘導結腸癌細胞凋亡。Yeh C C等[11]發現紫草素能誘導膀胱癌T24細胞凋亡。Min R等[12]發現紫草素能抑制口腔鱗癌Tca8113的增殖，并誘導其凋亡。Ying kun N等[13]發現紫草素能誘導人類肝癌HepG2細胞凋亡。自2003年起，國內逐步開始紫草素誘導細胞凋亡相關研究，如王禾等[14]研究紫草素對細胞凋亡的影響，表明紫草素是可以誘導角質形成層細胞的凋亡。2004年，以吳振為代表的學者們開始對紫草素誘導腫瘤細胞凋亡的廣譜性進行研究，包括角質形成層細胞、黑色素瘤A357-S2、宮頸癌HeLa[15]、膀胱癌細胞T24[16]、白血病細胞K562[17]、生殖系腫瘤細胞[18]、HL60[19]等，表明紫草素能誘導多種癌細胞凋亡。

3 紫草素誘導細胞凋亡的信號途徑

Hsu P C等[20]發現p53、p27、Bcl-2家族以及細胞色素c（Cyt c）的釋放，都與紫草素誘導的細胞凋亡有聯系。同年，Wu Z等[15]發現紫草素通過Caspase-9參與調控由p53介導的細胞周期的阻斷，引起細胞凋亡。2007年，Yeh C C等[11]發現紫草素誘導的細胞凋亡與Caspase-3相關。2008年Mao X等[21]發現紫草素通過ROS/JNK通路誘導細胞凋亡。2009年以后，研究者們開始研究其他藥物和紫草素的聯合作用，以及紫草素會產生的一些耐藥性，并取得了一些新進展。Han D W等[22]發現Nec-1能夠將紫草素誘導的壞死性細胞凋亡轉換為細胞凋亡，用Nec-1處理紫草素作用后的HL60細胞，細胞凝結現象和Caspase活性均增強，表明Nec-1能夠強化由紫草素誘導的細胞凋亡。Zhang F L等[23]發現紫草素和拓撲替康聯合作用，能誘導膠質瘤細胞凋亡。Wu H等[24]發現紫草素處理后癌細胞只產生了很低的抗性，并通過基因表達分析，紫草素產生較低的抗性和上調β微管蛋白相關。Hu X等[25]也發現凋亡誘導藥物作用在癌細胞上會產生一定的抗性，但這些細胞對紫草素誘導的壞死性細胞凋亡十分敏感。他們還提出紫草素與其他抗腫瘤藥物搭配，會克服單一藥物作用在癌細胞上產生的抗性。

3.1 經線粒體誘導的細胞凋亡途徑

線粒體途徑是細胞凋亡的三大途徑之一，線粒體膜的通透性降低、線粒體失活都將會導致細胞凋亡。線粒體途徑與Cyt c、凋亡誘導因子（AIF）、ROS、Bcl-2、p53等分子有密切的關系。紫草素在線粒體途徑中通過作用于細胞內的Bcl-2、p53，并促使細胞內產生ROS進而誘導細胞凋亡。

3.1.1 誘導產生活性氧引發細胞凋亡 紫草素可以誘導細胞產生ROS、谷胱甘肽（GSH），并誘導細胞凋亡。當清除細胞內ROS后，紫草素誘導的細胞凋亡受到明顯抑制，這表明ROS的產生與紫草素誘導的細胞凋亡有關。在產生ROS后，進一步產生高活性的自由基，使細胞的蛋白質、脂質、DNA結構、線粒體膜遭到氧化性破壞，促進Cyt c的釋放，引發細胞凋亡[13]。2011年Gong K等[26]用紫草素處理后的肝癌細胞中，檢測到大量ROS，同時細胞內清除ROS的化合物也被明顯抑制。2013年Ahn J等[27]發現紫草素處理后的癌細胞內ROS含量明顯上升，誘導細胞凋亡。

3.1.2 促進細胞色素c釋放，誘導細胞凋亡 Bcl-2家族是線粒體的外膜蛋白，在人的Bcl-2家族中，有些能抑制細胞凋亡，如Bcl-2和Bcl-XL，但是Bcl-2既屬于線粒體途徑又屬于死亡受體途徑，至今仍沒有明確的歸屬。

Wu Z等[28]研究發現紫草素對Bax、Bcl、Cyt c、p53的基因表達都有影響。通過免疫及印跡發現，紫草素處理A373-S2細胞后p53的表達隨之上調，并且Bax蛋白表達上調，而Bcl蛋白表達下調。之后，Cyt c大量釋放，誘導細胞凋亡。這說明，紫草素作用于Bcl-2家族誘導的細胞凋亡的機制之一是激活p53的表達，激活Bax導致Cyt c的釋放和Caspase的激活，引發細胞凋亡。2012年Chen C H等[29]利用半定量反轉錄PCR技術測定Bcl-2的表達，紫草素處理HL60細胞后Bcl-2的表達明顯下調。2013年Liu C[30]等使用定量PCR技術，發現紫草素能顯著增加乳腺癌細胞內Bax和Caspase-3的表達，同時降低Bcl-2的表達。

孤兒受體TR3/nur77可以被多種生長因子或凋亡信號誘導表達，能參與細胞的增殖、分化發育和凋亡過程[31]。Liu J[32]發現乙酰紫草素能提高細胞內的Nur77蛋白的含量，促進Bcl-2定位于線粒體，誘導細胞凋亡。這些充分表明紫草素誘導的細胞凋亡和Bcl-2有密切的聯系。

3.1.3 作用于CDK4誘導細胞凋亡 Chen C H等[29]還發現紫草素能上調U87MG細胞內p53的表達，并且紫草素誘導癌細胞產生ROS與p53的表達上調有關。Yang Q等[33]也發現紫草素誘導的細胞凋亡與ROS介導的DNA破壞和p53的表達上調有關系。紫草素能使p53表達增加之后有略微下調，紫草素對p53基因還有活化作用。p53作為重要的抗癌基因對G1和G2/M期有校正功能，p53的下游基因P21的編碼產物是一個依賴Cyclin的蛋白激酶，能與周期蛋白Cyclin結合，引起相應的蛋白激酶活性被抑制，阻斷細胞周期。在基因表達異常的情況下，突變型p53的活化，并不僅僅引起細胞對受損DNA的修復，還可以引起細胞凋亡。

3.2 經死亡受體介導的細胞凋亡途徑

Masuda Y等[34]發現紫草素能抑制腫瘤壞死因子相關受體蛋白TRAP1的基因的表達。他們用β-羥基異戊酰紫草素（β-HIVS）處理白血病細胞HL60、肺癌細胞DMS114后發現：在凋亡過程中，線粒體的中TRAP1蛋白的量逐漸減少。用TRAP1特異的siRNA處理肺癌細胞DMS114會對β-HIVS誘導的細胞凋亡更加敏感，并且促進線粒體中的Cyt c釋放。結果表明紫草素能降低TRAP1的表達，在誘導細胞凋亡過程中起到十分重要的作用。阮敏等[35]研究發現，紫草素作用于舌鱗細胞（Tca-8113）后，磷酸酶-IKKPAba蛋白表達下調，同時細胞核內的NF-κB與DNA的結合性也下降。這表明，紫草素抑制NF-κB的活性，在誘導細胞凋亡過程中扮演重要的角色。Piao J L[36]用紫草素處理后發現細胞內ATF3和DDIT3大量表達，而腫瘤壞死因子（TNF）則是增加的主體。ROS還可以通過腫瘤壞死因子受體超家族的信號轉導因子Fas及NF-κB來誘導細胞的的凋亡，從而實現由死亡受體介導的細胞凋亡途徑。這些都說明紫草素誘導的細胞凋亡和死亡受體途徑也有密切的聯系。

3.3 經內質網途徑介導的細胞凋亡途徑

內質網途徑是細胞凋亡的3大途徑之一，與蛋白質的應激反應、Ca2+、CHOP、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族都有密切聯系。紫草素能非競爭性抑制p-ERK的活性，活化c-JNK誘導細胞凋亡。

3.3.1 作用于c-JNK、p-ERK誘導的細胞凋亡 Gong K等[37]發現，利用紫草素處理肝癌細胞后，細胞內的c-JNK含量明顯提高。Singh F等[38]發現紫草素能非競爭性抑制pERK的活性，并活化c-JNK，通過調節p-ERK、JNK、PKC的活性，抑制腫瘤生長。利用人的表皮細胞，發現紫草素能抑制該細胞的增殖，通過降低EGFR、ERK1/2和酪氨酸的磷酸化水平，從而影響MAPK信號通路，使c-JNK的磷酸化水平增加。Mao X等[39]用紫草素處理慢性髓細胞性白血病細胞時，發現大量的細胞凋亡伴隨ROS的大量產生、c-JNK的活化和Cyt c的釋放。當抑制c-JNK的活化，或者消除活化的JNK后，Cyt c的釋放和細胞凋亡率都受到明顯的抑制。

p-ERK是內質網膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，激活p-ERK之后，能夠減緩蛋白質的合成作用，降低內質網應激反應的程度。但隨著p-ERK活化時間的增長p-ERK也可能會誘導CHOP蛋白的活化，加劇細胞內質網應激反應，并最終誘導細胞凋亡。紫草素能夠調節細胞內p-ERK的活化水平，從而在特定的情況下誘導細胞凋亡。紫草素能誘導c-JNK的活化，而活化后的c-JNK一方面能抑制Bcl-2抑制其抗凋亡活性，另一方面增強AP-1的活性進一步促進p53、Bax、Fasl等促凋亡蛋白的表達，促進細胞凋亡。

3.3.2 誘導Caspase-7、Caspase-12活化誘導細胞凋亡 Kretschmer N等[40]發現，紫草處理黑色素瘤細胞后，細胞內Caspase-7的活性增強。活化后的Caspase-7能轉移到內質網表面，與Caspase-12形成復合物，并最終活化釋放Caspase-12，誘導細胞凋亡。

3.4 其他凋亡途徑

3.4.1 降低PI3K/AKt磷酸化水平促進細胞凋亡 PI3K/ AKt信號途徑與細胞的增殖、分化、凋亡、腫瘤的發生關系非常密切。該通路可以調節腫瘤細胞的增殖、分化，若這條信號途徑發生異常反應，將會影響腫瘤細胞的擴散，血小管的形成，甚至還會影響腫瘤組織細胞外基質的降解[27]。

Wiench B等[41]利用miRNA和mRNA點陣技術分析，發現紫草素能通過降低Akt的磷酸化水平，影響PI3K-Akt-mTOR通路。PI3K-Akt-mTOR通路失控會造成腫瘤的發生。陳菊英等[42]利用紫草素處理MCF-7細胞，通過Western blot發現，該細胞的LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ隨之增加，p62蛋白的表達減少，總的PI3K、Akt的量減少，并且它們的磷酸化水平也會降低。這表明紫草素降低人乳腺癌細胞MCF-7細胞的活力與PI3K/Akt信號途徑相關。

3.4.2 破壞DNA結構促進細胞凋亡 紫草素能誘導超螺旋質粒pBR322 DNA的斷裂。Cheng H M[43]等發現紫草素有特定螯合功能，能誘導產生ROS，進而作用于Cu2+，誘導ROS和親氧化劑的產生，最終誘導Hela 細胞凋亡。其次紫草素還能作用于DNA TOPI和TOPⅡ。紫草素能抑制TOPI的活性，降低DNA的穩定性，增加DNA結構被破壞的可能性。紫草素還能參與DNA斷裂復合物的形成，TOPⅡ介導DNA斷裂。Masuda Y[44]運用cDNA點陣技術分析發現，紫草素能明顯抑制絲/蘇氨酸蛋白激酶-1（PLK-1）的活性，用紫草素處理后，U937和HL60細胞內PLK-1的含量和活性都明顯降低，從而降低DNA的穩定性，最終誘導細胞凋亡。

4 展望

盡管紫草素能誘導多種癌細胞凋亡，但距成熟的抗腫瘤藥物尚有一定的距離。就目前看來，還存在以下一些問題：①紫草素抗癌機理的研究都大多集中在細胞水平或單一的細胞系水平，針對某一組織或者器官的療效還有待考證；②目前紫草素誘導的細胞凋亡即使在體內也僅用于腫瘤異種移植，與真正的體內研究還有一段距離；③癌癥的治療往往需要藥物聯用，因此紫草素與其他藥物或其他治療手段的協同合作能力也有待進一步研究；④目前紫草素對正常細胞的不良反應研究比較缺乏，因此如何降低藥物不良反應，也是重點之一；⑤目前部分研究用一定量的紫草素作用于癌細胞一定時間后，再用其他抗癌藥物誘導癌細胞的凋亡，從而研究紫草素的耐藥能力，但是紫草素處理的量和作用時間以及不同的組織和個體對紫草素的耐藥有不同程度的影響，這些影響無疑阻礙紫草素成為成熟的抗癌藥物；⑥目前紫草素不止一種，左旋紫草素和其他紫草素在應用上也有很大差異，因此要針對不同情況使用不同藥物；⑦紫草素缺乏針對癌細胞的特異選擇性，會導致正常細胞毒害作用，因此可以嘗試對紫草素進行分子納米材料修飾，或用一層特異的脂質膜包裹，或添加磁性材料與紫草素結合，外加磁場的作用下，加強紫草對癌細胞的特異性選擇能力。以上問題阻礙了紫草素在臨床實踐中的運用，因此可以針對這些問題進行進一步的研究，以期盡早將紫草素廣泛運用于抗腫瘤臨床治療。

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（收稿日期：2015-12-25）

（修回日期：2016-01-18；編輯：向宇雁）