HPLC法測定注射用腺苷鈷胺有關物質

王金柱+徐瑩瑩

摘 要：目的：采用高效液相色譜法（HPLC法）測定注射用腺苷鈷胺有關物質含量。方法：應用C18色譜柱，流動相選磷酸二氫鉀-乙腈（PH調節采用磷酸，并將PH控制在3.2），最佳流速為1.0mL·min-1，柱溫控制在30攝氏度左右；檢測波長260nm，進樣量10μL；以此測定注射用腺苷鈷胺中有關物質的含量。結果：實驗中精密度及準確度等全部符合樣品分析的要求。其中，腺苷鈷胺、氰鈷胺與相鄰峰的分離度佳，其線性范圍分別是100～0.2μg·mL-1（R=0.9999）、10～0.1μg·mL-1（R=10000）。結論：HPLC法操作過程簡單、快速，精密度及準確率高，專屬性強，能夠良好的測定注射用腺苷鈷胺有關物質含量，值得推廣。

關鍵詞：注射用腺苷鈷胺；HPLC法；有關物質；氰鈷胺

注射用腺苷鈷胺為抗貧血藥，可用于貧血（巨幼紅細胞性、營養不良性、妊娠期）、神經根炎、三叉神經炎、坐骨神經痛、神經麻痹、多發性神經炎等疾病的輔助治療，也可以用于營養性神經疾患及由于放射線或藥物所引起的白細胞減少癥等[1]。腺苷鈷胺是維生素B12在人體內的活性輔酶之一，是細胞生長及繁殖、維持神經髓鞘完整性的必需物質之一[2]。然而，腺苷鈷胺缺點在于對酸、堿、光的不穩定性，且在制備過程中多產生雜質氰化鈷胺[3]。氰化鈷胺在結構上含有氰根這種劇毒性結構，其不能作為注射藥物。注射用腺苷鈷胺有關物質的測定利用吸光度法對藥品中氰化鈷胺一類已知雜質加以控制，因此， 運用恰當的方法測定注射用腺苷鈷胺內有關物質含量，來更加嚴格的控制藥品質量，保證藥品安全是十分重要的。

1 儀器與試劑、藥品

1.1儀器

電子天平，高效液相色譜儀。

1.2 試劑與藥品

腺甘鈷胺標準品；氰鈷胺對照品；注射用腺甘鈷胺樣品；色譜純：乙腈；分析純：磷酸二氫鉀、磷酸。

2方法

2.1.溶液的制備[4]

取腺甘鈷胺加水分別稀釋成含腺甘鈷胺1.0mg/mL和25μg/mL對照溶液，取氰鈷胺藥品，加水制備成含氰鈷胺2μg/mL的溶液作對照品溶液。

2.2色譜條件[5]

色譜柱為C18色譜柱；檢測波長260nm；柱溫大概控制在30攝氏度左右；流動相選磷酸二氫鉀-乙腈，選用磷酸來調節PH值，并將PH值大約控制在3.2。最佳流速設置為1.0mL·min-1；每次注入藥量為10μL。

2.3方法

取用10μL對照溶液注入高效液相色譜儀中，并調節好靈敏度，令主成份的峰高可以達到總量程的20%-25%之間。精密測量并取用供試品溶液，對照用溶液及氰化鈷胺對照品溶液，每種各為10μL，且將其分別注進高效液相色譜儀中，觀察并記錄色譜圖，并記下色譜圖達到主成分峰的保留時間的2.5倍。如果供試品溶液色譜中出現了與氰鈷胺相對應的峰，則要求含量小于1.0%，而供試品溶液中各種雜質的峰的面積的和必須小于等于主峰面積的兩倍。

2.4最低檢測限與定量限試驗

2.4.1腺苷鈷胺的檢測限及定量限

利用電子天平精確稱取腺苷鈷胺對照品，并對其加水進行稀釋，在已選定好的色譜條件下進行檢測。當腺苷鈷胺的信噪比達到10：1時，可計算出腺苷鈷胺的定量限約為0.915ng，而在信噪比為3：1的時候，計算出的腺苷鈷胺的定量限大概是0.57。

2.4.2氰鈷胺的檢測限和定量限

利用電子天平精確稱取氰鈷胺對照品，并對其加水進行稀釋，在已選定好的色譜條件下進行檢測。當氰鈷胺的信噪比達到10：1時，可計算出腺苷鈷胺的定量限約為0.915ng，而在信噪比為3：1的時候，計算出的氰鈷胺的定量限大概是0.57。

3 結果

實驗中精密度及準確度等全部符合樣品分析的要求。其中，腺苷鈷胺、氰鈷胺與相鄰峰的分離度佳，其線性范圍分別是100～0.2μg·mL-1（R=0.9999）、10～0.1μg·mL-1（R=10000）。

4 討論

腺苷鈷胺是維生素B12在人體內的活性輔酶之一，是細胞生長及繁殖、維持神經髓鞘完整性的必需物質之一，腺甘鈷胺常被用來治療巨幼細胞性貧血、妊娠期貧血等，還被用來輔助治療各類神經炎等神經性疾病[6-9]。但是，其成分內的有關物質的相關研究文獻較少。而其中，氰鈷胺及羥鈷胺是現階段已知的注射用腺甘鈷胺成分中的雜質[10-12]。由于藥物的生產工藝的改變，其中的雜質物質不能夠有效的分離出去[13]。因此，為達到提高腺甘鈷胺主成分峰與雜質峰的分離度的目的，本文設計的實驗則是選用適合于HPLC法條件的樣品，改善有關物質和待測成分的分離的效果，并控制總的雜質與氰鈷胺。

HPLC法方法簡單，操作便利、快捷，且具有很高的靈敏度，準確度、檢測限與定量限全部附合相關要求，適合用于控制注射用腺甘鈷胺有關物質，值得推廣[14-15]。

參考文獻

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作者簡介：王金柱，哈爾濱三聯藥業股份有限公司，工程師，150025，本科，1989年03月03日，藥品質量方向。