環磷腺苷葡胺注射液細菌內毒素檢測研究

李巖+劉云娜

摘 要：目的：探究環磷腺苷葡胺注射液細菌內毒素檢查方法的可行性。方法：確定該供試品的細菌內毒素理論限值后，分別用兩種不同廠家生產的鱟試劑對3批供試品進行干擾試驗。結果：注射用環磷腺苷葡胺稀釋40倍時對細菌內毒素檢查法沒有干擾作用，細菌內毒素限值符合規定。結論：該方法操作簡便、靈敏，可用此法代替原有的家兔熱原檢查法。

關鍵詞：細菌內毒素；環磷腺苷葡胺；鱟試劑；干擾試驗

環磷腺苷葡胺注射液是一種非洋地黃類強心劑，可用于冠心病、心肌梗死等，也可用于急性白血病的緩解治療[1-2]。《中國藥典》2010年版規定以家兔法進行熱原檢查，但家兔法操作繁瑣，在實際情況中家兔體溫會有異常波動，給檢驗造成困難[3]。本文進行了細菌內毒素檢查法代替家兔法的可行性試驗，現報告如下。

1.材料與方法

1.1 材料

注射用環磷腺苷葡胺（山東綠葉制藥有限公司，批號：201404198、201406074、201408367，規格：60 mg）。鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司提供，批號：0508215，規格：0.1 mL/支，靈敏度：0.125EU·mL-1；廈門鱟試劑廠提供，批號：0406345，規格：0.1 mL/支，靈敏度：0.125EU·mL-1）。細菌內毒素檢查用水BET水（福州新北生化工業有限公司，批號：0909267，規格：5 mL/支）。

1.2. 方法

1.2.1 細菌內毒素理論限值（L）的計算

根據公式L=K/M計算，L為供試品注射用環磷腺苷葡胺的細菌內毒素理論限值，K和M分別為人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量和供試品劑量[4]，計算得出L=5EU·mg-1。

1.2.2 供試品最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

根據公式MVD=C·L/λ計算，L為供試品注射用環磷腺苷葡胺的細菌內毒素理論限值，C為供試品稀釋后的樣品濃度，λ為鱟試劑的靈敏度值，計算出1g·L-1的環磷腺苷葡胺溶液的MCD=40。

1.2.3 供試品的最大不干擾濃度的干擾試驗

用BET水將供試品梯度稀釋成0.10 g·L-1、0.05 g·L-1、0.025 g·L-1、0.0125 g·L-1、0.00625 g·L-1共5種濃度的稀釋液。同時配制供試品陽性溶液，供試品陽性溶液為上述各溶液分別添加2λ（0.25EU·mL-1）的細菌內毒素樣品溶液制成。將鱟試劑用0.1 mLBET水溶解后，分別加入0.1 mL上述配制的各稀釋濃度的供試品樣品溶液和供試品陽性溶液，并設置陰性對照和陽性對照，37℃孵育1h后，觀察實驗結果，以此初步確定供試品的最大不干擾濃度[5]。

1.2.4 供試品的最大不干擾濃度的確證試驗

根據上述干擾試驗結果，確認選擇0.025g·L-1濃度的供試品稀釋溶液。用BET水和0.025g·L-1供試品溶液分別將細菌內毒素工作標準品梯度稀釋為0.25 EU·ml-1、0.125 EU·ml-1、0.0625 EU·ml-1和0.03125EU·ml-1共4種濃度的稀釋液。將鱟試劑用0.1 mL BET水溶解后，分別加入0.1 mL上述配制的各濃度稀釋液，37℃孵育1h后，觀察實驗結果。

1.2.5 供試品的細菌內毒素檢查試驗

將供試品用BET水配制成0.025g·L-1的稀釋液，并同時設置試品陽性對照（2λ）、陰性對照和陽性對照（2λ），將鱟試劑用0.1 mL BET水溶解后，分別加入0.1 mL上述配制的各濃度稀釋液，37℃孵育1h后，觀察實驗結果。

2 結果

2.1 供試品的最大不干擾濃度的干擾試驗

結果顯示各稀釋濃度對鱟試劑均無干擾反應，由于計算出1g·L-1的環磷腺苷葡胺溶液的理論MCD為40，因此初步確定供試品的最終有效稀釋濃度為0.025g·L-1，詳見表1。

2.2 供試品的最大不干擾濃度的確證試驗

結果顯示，供試品的稀釋濃度為0.025g·L-1，對兩個不同廠家生產的鱟試劑均沒有產生干擾反應，詳見表2。

2.3 供試品的細菌內毒素檢查試驗

結果顯示對3批環磷腺苷葡胺注射液進行細菌內毒素檢查時，可以用稀釋方法排除干擾，測定結果均為陰性，符合規定，詳見表3。

3.討論

鱟試劑是一種公認的細菌內毒素檢測用試劑，可廣泛用于化學藥、中藥、生物制品等藥物的細菌內毒素檢測[6]。但許多藥品對凝集反應具有一定的增強或減弱的干擾作用，使其結果并不準確，只有驗證了供試品的稀釋濃度對上述凝集反應沒有干擾作用，鱟試劑的內毒素檢測結果才具有準確性和可信性。本文研究結果顯示供試品的稀釋濃度為0.025g·L-1，對兩個不同廠家生產的鱟試劑均沒有產生干擾反應，且40倍的注射用環磷腺苷細菌內毒素含量低于理論限值5EU·mg-1，表明用鱟試劑法檢測該供試品的細菌內毒素這一方案是可行的。

綜上所述，該方法操作簡便、靈敏度高，可用此法代替原有的家兔熱原檢查法以達到安全用藥的目的。

參考文獻

[1] 吳世斌， 安麗娟， 孫林， 等. 環磷腺苷葡胺注射液細菌內毒素檢查方法的研究[J]. 中國生化藥物雜志， 2012， 33（3）：287-302.

[2] 王玉華， 李麗萍， 劉茜. 注射用環磷腺苷葡胺細菌內毒素檢查[J]. 齊魯藥事， 2011， 30（3）：146-147.

[3] 楊娟， 李界剛， 朱愛. 環磷腺昔注射液細菌內毒素檢查方法探討[J]. 中國藥師， 2013， 16（1）：144-145.

[4] 蔡彤， 張國來， 李波等. 84種注射用藥品細菌內毒素檢查法的方法學研究[J]. 中國藥學雜志， 2010， 45（2）：150-155.

[5] 黃麗榮，許善初，石慶平. 注射用環磷腺苷細菌內毒素檢查方法的建立[J]. 安徽醫藥， 2006， 10（8）：567-568.

[6] 王宗春， 郭咸希. 注射用二丁酰環磷腺苷鈣細菌內毒素檢查法的可行性研究[J]. 湖北大學學報（自然科學版）， 2013， 35（4）：480-483.

作者簡介：李巖，單位：黑龍江威凱洱生物技術有限公司，職稱：助理工程師，單位郵編：150028，學歷：本科，1981年出生。