雷帕霉素對雄性小鼠生殖能力的影響及相關機制探討

謝 婕

(南京醫科大學生殖醫學國家重點實驗室，江蘇 南京 211166)

不孕不育癥是影響人類生殖繁衍的主要疾病。在全球，有近15%的育齡夫妻受到此病的影響。在不孕不育癥患者中，女性不孕癥患者和男性不育癥患者各占50%[1]。不育癥主要是由男性體內激素分泌紊亂、染色體突變、DNA受損或罹患代謝疾病等引起其精子的發生過程異常所致[2]。精子的發生過程受到多重嚴密基因/蛋白網絡的調控，mTOR信號通路等相關的信號通路在其中發揮著重要的作用。mTOR信號通路由mTORC1和mTORC2兩種復合體組成，Raptor和Rictor分別是這兩種復合體中的特異蛋白。mTOR信號通路最早被證實在細胞增殖、細胞骨架形成、糖脂代謝方面發揮著重要的作用。將小鼠體內的Raptor和Rictor基因進行全身性敲除會導致其在胚胎期死亡。因此，mTOR信號通路與小鼠的胚胎發育有關。雷帕霉素（Rapamycin）是mTOR信號通路的重要抑制劑，能夠與mTOR蛋白直接結合，抑制其信號通路的功能。在臨床上，雷帕霉素曾被廣泛用于進行腎臟移植和癌癥的治療中，但男性患者在用藥的過程中可發生不育癥，其表現為不同程度的少精甚至無精[3]。本研究主要探討雷帕霉素造成雄性小鼠不育的原因，并分析雷帕霉素引發的雄性小鼠不育癥與mTOR信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及喂食方案

本次實驗中的29只SPF級B6雄性小鼠由南京醫科大學動物中心提供，其中包括3.5 d的小鼠8只，10 d的小鼠4只，14 d的小鼠2只，21 d的小鼠2只，8 w的成年小鼠13只。將其中各日齡的小鼠用于檢測不同日齡小鼠睪丸mTOR/Raptor/Rictor基因（蛋白）表達的水平，將其中12只8 w的小鼠用于構建喂食組小鼠模型（分為對照組小鼠6只與喂食組小鼠6只）。將雷帕霉素（14 ppm）添加入小鼠的飼料中。采用2.25 mg/kg的劑量體重比為喂食組小鼠喂食該飼料4周。為對照組小鼠喂食正常的飼料。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠睪丸蛋白的提取及檢測 取4只3.5 d、2只10 d、1只14 d、1只21 d、1只8 w的成年小鼠、喂食4周后的對照組成年小鼠和喂食組成年小鼠各3只（對照組和喂食組小鼠附睪用于后續精子活力檢測實驗），用脊椎脫臼法將其處死，打開其腹腔，取其兩側的睪丸用1ml的RIPA裂解液（南京諾維贊公司提供）進行研磨裂解，以12500 rpm的轉速進行高速離心操作后取上清液，取2 μl的上清蛋白用BCA蛋白濃度檢測試劑盒（南京諾維贊公司提供）進行濃度檢測，用10%的SDS膠進行蛋白電泳，需要檢測的抗體包括mTOR/Raptor/Rictor/p-S6/p-S473-AKT/p-T308-AKT抗體（CST公司提供）、β-Actin抗體（Sigma公司提供）。

1.2.2 小鼠睪丸總RNA提取及mRNA表達檢測 取4只3.5 d、2只10 d、1只14 d、1只21 d、1只8 w的成年小鼠，采用脊椎脫臼法將其處死，打開其腹腔，取其兩側的睪丸用1ml的Trizol（Invitrogen公司提供）進行研磨裂解，以12500 rpm的轉速進行高速離心操作后取上清液，在上清液中加入200 μl的氯仿，混勻后以12500 rpm的轉速進行高速離心操作后取最上層液體，在最上層液體中加入500 μl的異丙醇混勻，以12500 rpm的轉速進行高速離心操作后倒掉上清液、保留沉淀。用75%的乙醇清洗沉淀，以7500 rpm的轉速進行離心操作，倒掉乙醇，晾干沉淀，加水溶解RNA樣品，用總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司提供）逆轉錄成cDNA。將cDNA樣品用SYBR green試劑盒（TAKARA公司提供）進行熒光定量PCR檢測，以36B4作為內參基因。

1.2.3 引物合成 本實驗中所用的引物均合成于上海生工生物工程公司，引物序列為：mTOR序列（Forward:5’-ACCGGCACACATTTGAAGAAG-3’；Reverse:5’-CTCGTTGAGGATCAGCAAGG-3’）。Rictor序 列（Forward:5’-TGTGGCCAAATTACAAGGAG-3’；Reverse:5’-TCTCCACCTCATTGCTCTG-3’）。Raptor 序列（Forward:5’-TTTGTCTACGACTGTTCCAATGC-3’；Reverse:5’-GCTACCTCTAGTTCCTGCTCC-3’）。36B4序 列（Forward:5’-GCAGATCGGGTACCCAACTGTTG-3’Reverse：:5’-CAGCAGCCGCAAATGCAGATG-3‘）。

1.2.4 小鼠睪丸和附睪HE切片制備及染色 取喂食4 周后的對照組成年小鼠和喂食組成年小鼠各3只，用脊椎脫臼法將其處死，打開其腹腔，取新鮮的小鼠睪丸和附睪于Bouin固定液（Sigma公司提供）中固定48 h。將固定后的組織放入包埋框脫水，在脫水后進行石蠟包埋，包埋完成后進行切片。將此組織切片放入65℃的烘箱中過夜脫蠟，用蘇木精-伊紅（Sigma公司提供）染色法進行染色，用中性樹脂封片劑封片，在37℃的烘箱過夜。

1.2.5 精子活力檢測 取喂食4周后的對照組成年小鼠和喂食組成年小鼠各3只，用脊椎脫臼法將其處死，打開其腹腔，取出其附睪，放入PBS緩沖液中輕柔地剪碎附睪，將樣品置于37℃水浴箱中進行溫育，取10 μl含有精子的PBS混合液用CASA檢測儀進行檢測。

1.3 觀察指標

采用Western blot結合RT-PCR法檢測mTOR信號通路重要組分蛋白在不同日齡的小鼠睪丸中表達的水平。采用睪丸和附睪HE染色法觀察兩組小鼠睪丸的大小、生精細胞的發育狀況及附睪內精子的數目。采用CASA檢測儀檢測察兩組小鼠成熟精子的活力。采用western blot法檢測對照組和喂食組小鼠睪丸組織中mTOR通路重要組分蛋白表達的水平。

1.4 統計學處理

每個實驗設計3組生物學重復樣品。采用SPSS20.0統計軟件對本研究中的數據進行分析，計量資料用（2±s）表示，采用t檢驗，計數資料用%表示，采用χ 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mTOR信號通路重要組分基因（蛋白）在不同日齡小鼠睪丸中的表達水平

對mTOR/Raptor/Rictor在不同日齡小鼠睪丸中表達的水平進行檢測的結果顯示，mTOR和Raptor在21 d的小鼠睪丸中呈高表達，Rictor在14 d的小鼠睪丸中呈高表達。詳見圖1。粗線期精母細胞在小鼠出生后的第14 d開始在其體內產生，在其出生后的21 d在睪丸生精細胞中占比最高。mTOR信號通路重要組分基因（蛋白）的表達可能與小鼠睪丸組織中粗線期精母細胞的發育有關。

圖1 mTOR信號通路重要組分基因（蛋白）在不同日齡小鼠睪丸中表達的水平：（A-C）mTOR/

2.2 對照組和喂食組小鼠生殖表型的觀察

對照組小鼠的體重為（22.83±0.67）g，其睪丸的重量為（85.58±9.03）mg。喂食組小鼠的體重為（23.32±0.74）g，其睪丸的重量為（38.19±5.12）mg。與對照組小鼠相比，喂食組小鼠的睪丸重量減小（t=7.907，P=0.001）。與對照組小鼠相比，喂食組小鼠的精子活力較弱，其精子中快速、中速及慢速運動精子的占比較低，其精子中不運動精子的占比較高（P＜0.05）。詳見圖2B 。HE染色的結果顯示，與對照組小鼠相比，喂食組小鼠睪丸中各級生精細胞的排布較混亂（圖2C-D），其附睪中精子的細胞數量較少（部分管腔呈空泡狀態）。詳見圖2E-F。

圖2 對照組和喂食組小鼠生殖表型的比較：（A）其睪丸大小的比較。（B）其精子活力的比較。（C-D）其睪丸HE染色結果的分析。（E-F）其附睪HE染色結果的分析。

2.3 對照組和喂食組小鼠mTOR通路重要蛋白表達水平的比較

與對照組小鼠相比，喂食組小鼠睪丸組織中mTOR信號通路重要組分蛋白Raptor/Rictor表達的水平下降，下游直接作用蛋白p-S6、p-S473-AKT、p-T308-AKT表達的水平也下降。詳見圖3。喂食組小鼠睪丸組織中mTOR信號通路直接作用蛋白表達水平的顯著下降，提示其mTOR信號通路受到破壞。

圖3 用Western blot檢測對照組和喂食組小鼠mTOR通路重要蛋白表達的水平。

3 討論

雷帕霉素是一種免疫抑制劑，具有促進細胞自噬、增強干細胞的功能、抑制癌癥的發生等作用，在臨床上曾被廣泛用于進行腎臟移植和癌癥治療的過程中。在使用雷帕霉素對男性患者進行治療時，會導致部分患者出現少精和弱精癥，但其致病機制尚未完全闡明。

既往的研究結果表明，mTOR信號通路在細胞的增殖、分化、細胞骨架的形成中均發揮著重要的作用[4-5]，且越來越多的研究證實mTOR信號通路與小鼠睪丸生殖細胞的發育相關。mTOR信號通路上游抑制因子的表達能夠提高精原干細胞自我更新的能力[6]。mTORC1復合體核心組分Raptor與原始生殖細胞的增殖能力相關[7]。將Raptor條件性敲除后動物體內精母細胞減數分裂的過程可受到阻滯[8]。

研究發現，雷帕霉素分子能夠與mTOR蛋白直接結合，進而可抑制mTOR信號通路的功能。本研究通過給小鼠喂食雷帕霉素，觀察此藥對小鼠生殖能力的影響，結果顯示，雷帕霉素可作用于mTOR信號通路，進而影響小鼠睪丸和附睪的生理結構和功能，使其出現睪丸重量減小、睪丸曲細精管內部各級生精細胞排列混亂、附睪中精子細胞的數目減少、成熟精子活力降低等情況。此外，mTOR信號通路重要蛋白mTOR/Raptor/Rictor主要表達于粗線期精母細胞中。上述結果證實，免疫抑制劑雷帕霉素可通過抑制mTOR信號通路的功能導致小鼠生殖能力異常，其作用與睪丸組織粗線期精母細胞功能異常相關。

綜上所述，雷帕霉素能夠導致雄性小鼠睪丸和附睪的結構異常，影響其睪丸中成熟精子的生成。雷帕霉素可通過影響mTOR信號通路的功能干擾雄性小鼠精子發生的過程。

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