家兔缺血再灌注型急性腎功能不全模型在實驗教學中的應用

田 瑋，馬尚寅，龔延萍*，白志慧，哈斯巴根，鋼蘇和

（1.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古自治區人民醫院，內蒙古 呼和浩特 010017；3.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110）

家兔缺血再灌注型急性腎功能不全模型在實驗教學中的應用

田 瑋1，馬尚寅2，龔延萍1*，白志慧3，哈斯巴根3，鋼蘇和3

（1.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古自治區人民醫院，內蒙古 呼和浩特 010017；3.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110）

目的 評價以缺血再灌注方法復制的家兔急性腎功能不全模型的教學實用性、實驗效果及穩定性等，探索適合學生實驗的安全、快速、有效的急性腎功能不全動物模型建立方法。方法 對20只家兔采取切除右腎并夾閉左腎動脈45 min后再灌注15 min的方法建立急性腎功能不全模型，對比缺血再灌注前后腎臟形態、血肌酐（Cre）及尿素氮（BUN）、尿蛋白等指標。結果 缺血再灌注腎臟含血量顯著下降，腎臟大體形態與缺血再灌注前有肉眼可見的顯著區別。缺血再灌注后血樣BUN、Cre值較前均有所提高（P＜0.05）。結論 缺血再灌注家兔急性腎功能不全模型建立方法安全無毒，可在有限的實驗教學時間內完成，且操作難度適宜，便于實驗前后對照，實驗效果良好，可用于機能學實驗等教學。

急性腎功能不全；缺血再灌注；動物模型；家兔；實驗教學

急性腎功能衰竭是急性腎功能不全的晚期階段，在臨床上兩者往往屬于同一概念而不加區別[1]。該病病情發展急，病死率高，是臨床常見的危重病之一，一直受到醫學界的廣泛關注，常應用于醫學實驗教學和基礎醫學研究。

根據急性腎功能不全病因的不同，復制動物模型的方法也不同，如去甲腎上腺素滴注法、低灌注法、順鉑誘導、油酸法、結扎雙側輸尿管，等等[2]。對一般醫學實驗教學而言，上述任意一種方法均能滿足教學需要，此時模型復制方法的便捷性、穩定性、安全性以及實驗效果的顯著性等則成為選擇造模方法時優先考慮的因素。

現階段我國對缺血性腎功能衰竭模型的研究主要基于大鼠[3～5]和小鼠[6]，但大鼠、小鼠體型較小，對學生實驗而言操作難度較大；腎的體積也小，不利于進行細致觀察。相對而言，家兔體型較大，手術操作更為簡單，腎的體積也更利于觀察比較。但目前基于家兔的實驗研究相對較少，針對醫學實驗教學的急性腎功能不全動物模型復制研究的文獻僅有幾篇。本文以自身對照方式，對家兔腎缺血再灌注前后腎形態、血肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、尿蛋白等指標的變化情況進行比較，評價缺血再灌注方法復制家兔急性腎功能不全模型的教學實用性、實驗效果及穩定性等。

1 材料與方法

1.1 實驗方法

（1）取健康家兔20只，體重2～3 kg，雌雄不限。

（2）麻醉：耳緣靜脈注射20%氨基甲酸乙酯5 ml/kg進行麻醉，麻醉后仰臥位固定。

（3）手術：頸部正中縱形切口，分離一側頸總動脈；于恥骨聯合向上做正中縱切口，暴露膀胱。

（4）術前取樣：頸總動脈取血，分別做BUN、Cre測定，并從膀胱內抽取尿液做尿蛋白定性試驗。

（5）缺血再灌注造模：①自胸骨劍突向下沿腹白線做正中縱切口（7～10 cm）[7]，鈍性分離肌肉，將腹腔內容物推向左側，于右側后腹壁找到右腎及右腎蒂等組織，結扎并剪斷右腎蒂，摘除右腎[8]（右側腎蒂短，腎動脈不易分離，摘除后左側腎能夠完全代償，不會影響實驗結果[9]）。將腹腔內容物推向右側，在左側后腹壁找左腎及左腎蒂，分離左腎動脈約1 cm。②阻斷血流：用動脈夾阻斷左腎血液供應（夾閉左側腎動脈前，先將左腎動脈夾閉數秒后恢復血供，反復數次，使其缺血預適應，避免急性缺血損傷難以恢復[10，11]）。③恢復血流：阻斷血流45 min[3]后，松開左腎動脈夾，恢復腎血流[12]，此時腎臟顏色由蒼白逐漸轉紅，表明再灌注成功，觀察無出血后關閉腹腔。

（6）利尿：由耳緣靜脈緩慢注射37℃0.9%生理鹽水50 ml，幫助利尿。

（7）灌注后取樣：缺血再灌注15 min后，再次從頸總動脈取血分別做BUN、Cre測定，并從膀胱內抽取尿液做尿蛋白定性試驗。

（8）處死尸檢：處死家兔取腎，觀察腎臟外觀（體積、顏色、包膜緊張度等）及縱切面形態學（皮、髓質分界和色澤等）改變。

1.2 觀察指標

腎臟外觀及縱切面形態，血尿素氮，血肌酐，尿蛋白等指標。

1.3 統計學方法

數據以均數±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，結果比較采用t檢驗、卡方檢驗或方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 形態學觀察

對正常腎和缺血再灌注后的實驗腎進行比較，可以明顯看出正常腎皮質、腎髓質界限明顯，整體顏色偏紅，含血量較高；而缺血再灌注后的腎皮質、腎髓質界限不清，大部分切面為淺粉色至白色，含血量較低。

2.2 血生化指標（見表1）

表1 家兔腎缺血前與缺血再灌注后血BUN、Cre比較（±s）

表1 家兔腎缺血前與缺血再灌注后血BUN、Cre比較（±s）

t值P值BUN（mg/dL）Cre（μmol/L）缺血前4.45±0.60 73.07±9.41缺血再灌注后4.70±0.79 187.63±19.55 2.118 24.897 0.048 0.000

3 討論

急性腎功能不全的原因以急性腎小管壞死最為多見，而急性腎小管壞死的主要原因是腎缺血、再灌注損傷和急性腎中毒。當發生持續腎缺血以及再灌注時，腎小管上皮細胞因持續缺血或再灌注損傷而壞死；當化學、生物、藥物性毒素或大量血紅蛋白、肌紅蛋白從腎排泄時，腎小管上皮細胞可因中毒而變性壞死[1]。因此，腎功能不全動物模型的復制方法主要有缺血性和中毒性兩大類[11～13]，目前較常用的方法有5種[14]，即夾閉腎動脈，滴注去甲腎上腺素，注射汞劑（Hgcl2）、硝酸鈾或甘油，前兩種方法的目的是使腎發生嚴重缺血，第三、四種方法誘導發生急性腎中毒，最后一種方法兼有缺血性和內源性毒物中毒兩類的特點[15]。其中，皮下或肌肉注射汞劑由于操作簡單、創傷小、病變穩定，且重金屬汞是腎小管上皮細胞的特異性毒物，而被作為經典方法常在實驗教學中使用。但此種模型建立方式存在接觸者中毒風險、“三廢”排放問題、造模時間長、學生造模成功率低、動物浪費嚴重、不便于自身對照等弊端。因此，急需改進實驗教學中腎功能不全動物模型建立方式，找到適合學生實驗的安全、快速、有效的方法。

本實驗中夾閉腎動脈后，腎組織血流阻斷，腎微循環發生嚴重障礙，造成腎實質細胞缺血、缺氧，三磷酸腺苷（ATP）生成減少，從而發生能量代謝障礙，影響腎小管主動性離子交換功能，吸收和排泄功能均受到影響。如果ATP進一步降低，則導致細胞膜損傷，細胞外鈣離子內流，細胞內鈣離子濃度增加，使細胞發生下列不可逆的損傷：（1）腎小球毛細血管內皮細胞、系膜細胞、足細胞發生腫脹、退變；（2）腎小管周圍毛細血管內皮細胞及腎小管上皮細胞腫脹壞死；（3）腎小管壞死及壞死后脫落的細胞碎片可使管腔阻塞導致原尿回漏，引起間質水腫；（4）毛細血管壁遭到破壞，通透性增加，水分透過管壁進入組織，加重間質水腫。在以上因素的共同作用下，腎組織血流量減少，腎小球濾過率降低。濾過膜本身的破壞及腎小球壞死又減少了濾過面積，加重了腎小球濾過功能障礙，最終引起腎臟排泄功能衰竭[16]。

缺血再灌注家兔急性腎功能不全模型采用切除右腎并夾閉左腎動脈的方法，無需借助藥品，避免了使用劇毒化學藥品HgCl2的問題，既解決了中毒動物處理及環境污染問題，又規避了毒麻藥品管理風險。另外，由于學生在動物實驗課上手術技能訓練較多，因此模型建立操作難度適宜，且判斷操作成功與否較肌肉注射更為容易，故該方法的造模成功率相對更高。此外，缺血再灌注的復制過程可在有限的教學時間內完成，較HgCl2中毒（至少提前24 h注射）等造模方法周期短，在一次實驗中完成從正常到疾病發生、發展、轉歸過程的觀察，優化了實驗流程，使實驗節奏性更強；且可設立自身對照，進行實驗前后相關指標比較，較空白對照結果更穩定、更具說服力。同時，由學生自主完成實驗模型的建立，可進一步加深印象，提高教學效果。

但是，我們觀察發現：實驗中缺血再灌注的家兔血尿素氮變化并不明顯，再灌注后升高程度不及HgCl2中毒性模型的血液生化指標變化明顯，這可能由于教學實驗中BUN變化尚處于升高初期（BUN于再灌注16 h達到高峰[13]），也可能由于本實驗中家兔品系不純、影響因素多等。另外，由于缺血再灌注模型需以外科手術方法造模，病理改變有局限性[14]，動物的耐受性及學生手術操作熟練程度和水平，都是值得商討的問題。考慮實驗動物、條件及方法等因素，尚需進一步探討。從實驗原始結果來看，由于實驗處理后動物腎功能受損，尿量明顯下降甚至無尿，往往不能測定尿蛋白和酚紅排泄率，因此以往實驗中用到的這兩種檢測指標，并不適用于急性腎功能不全模型。

綜上所述，兩種模型復制方法各有優缺點，應根據不同的實驗目的加以選擇。缺血再灌注家兔急性腎功能不全模型建立方法安全無毒，可在有限的教學時間內完成，且操作難度適宜，便于實驗前后對照，實驗效果良好，可用于對模型特異性要求不高的機能學實驗等醫學實驗教學。

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（*通訊作者：龔延萍）

G424.4

B

1671-1246（2017）03-0096-03

注：本文系內蒙古醫科大學實驗室開放基金指南型項目（kfsyszn201416）