浙江省12個區(縣)分枝桿菌菌種鑒定及耐藥相關基因特征分析

徐凱進 嵇仲康 胡海洋 畢晟 胡飛樞 鄭琳 金秀媛 徐文杰 王淑婷 楊美芳 邵俊丹 李鵬程 黃艷芳 盛吉芳 李蘭娟

·論著·

浙江省12個區(縣)分枝桿菌菌種鑒定及耐藥相關基因特征分析

徐凱進 嵇仲康 胡海洋 畢晟 胡飛樞 鄭琳 金秀媛 徐文杰 王淑婷 楊美芳 邵俊丹 李鵬程 黃艷芳 盛吉芳 李蘭娟

目的 了解浙江省12個區(縣)分枝桿菌菌種流行情況及結核分枝桿菌的INH、RFP耐藥相關基因特征。方法 收集2012年1月至2016年6月浙江省12個區(縣)初診為菌陽肺結核患者的2803株臨床分離菌株標本，運用基因芯片技術進行菌種鑒定和INH、RFP耐藥檢測。結果 2803份菌株中，NTM占7.3% (205株)，前6位菌種為：胞內分枝桿菌101株，堪薩斯分枝桿菌50株，龜-膿腫分枝桿菌24株，鳥分枝桿菌16株，偶然分枝桿菌4株，淺黃色分枝桿菌1株；2598株MTB中耐INH者占12.5% (326株)，耐RFP 者占9.8% (254株)，MDR 占6.7% (173株)。425株MTB耐藥突變位點結果中，katG315位點占INH耐藥突變的81.1% (279/344)，rpoB531位點占RFP耐藥突變的56.6% (155/274)。結論 通過涂片診斷肺結核患者中有13.5% (378/2803)為NTM和MDR感染，INH耐藥的主要突變位點是katG315，RFP耐藥的主要突變位點是rpoB531，在基層醫療機構積極推行分枝桿菌菌種鑒定技術和耐藥檢測技術將有利于加快我國結核病疫情控制。

分枝桿菌, 結核； 分枝桿菌, 非典型性； 抗藥性, 多種, 細菌； 基因, MDR； 點突變； 數據說明, 統計

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是泛指結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)和麻風分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)以外的分枝桿菌[1-2]，抗酸染色呈陽性是兩者的共同特征。MTB和 NTM均可引起肺部感染，出現的癥狀和肺部影像學表現非常相似， 臨床上很難鑒別。與許多發展中國家一樣，在中國痰涂片找抗酸桿菌仍然是許多基層衛生機構診斷肺結核的唯一細菌學依據，缺乏MTB培養、菌種鑒定、耐藥檢測能力。在此狀況下，NTM、耐多藥(multiple drug resistance, MDR) MTB感染均被診斷為肺結核，并接受國家推行的標準抗結核藥物化療方案治療(2H-R-Z-E/4H-R或2H2-R2-Z2-E2/4H2-R2)，誤診誤治的結果導致病情遷移不愈，患者傳染性持續存在，對患者與社會均造成了傷害。

掌握被基層醫療衛生機構初診為“肺結核”的患者中，MDR與NTM感染所占比例，了解NTM的流行情況和INH與RFP相關耐藥突變基因特征，對中國結核病防控策略的完善與修訂具有現實意義，對其他國家的結核病防控也有一定的借鑒價值。筆者對浙江省12個縣(市)初診為菌陽肺結核患者的2803份臨床分離菌株標本，運用基因芯片技術進行菌種鑒定和INH、RFP耐藥檢測，現將結果報告如下。

資料和方法

一、研究對象

2012年1月至2016年6月，浙江省12個區(縣)共完成18 722例結核病疑似患者痰液培養，每份痰標本分別接種于2支羅氏固體培養基(L?wenstein-Jensen medium，L-J medium )，其中有2803份痰標本培養陽性并經過萋-尼染色法(Ziehl-Neelsen stain)證實為抗酸桿菌(acid-fast bacilli)。

二、 實驗方法

1. 菌株來源地情況：浙江省位于中國東南沿海長江三角洲南翼，地勢由西南向東北傾斜，可分為平原、丘陵、盆地、山地、沿海平原及島嶼等地形。選擇浙江省12個區(縣)，分別為浙江省紹興市柯橋區(原紹興縣)、桐鄉市、舟山市普陀區、舟山市臨城新區、桐廬縣、湖州市吳興區、湖州市南潯區、德清縣、安吉縣、三門縣、玉環縣和仙居縣。上述區(縣)涵蓋了各種流行病學特征，不同流行學水平，高中低經濟發展程度，山區、平原、海島不同地形。12個區(縣)覆蓋人口582.16萬名(2010年數據)，分別為紹興柯橋區72.70萬名，桐鄉市67.4萬名，舟山市普陀32.13萬名，舟山定海區臨城新區37.59萬名，桐廬縣40.25萬名，湖州市吳興區59.85萬名，湖州市南潯區49.06萬名，德清縣43萬名，安吉縣45.77萬名，三門縣42.92萬名，玉環縣41.96萬名，仙居縣49.53萬名[3]。2012年，在以上區(縣)實行結核病疑似患者[咳嗽、咯痰≥2周，和(或)胸部X線檢查有可疑結核病灶]分枝桿菌培養，并收集所有培養陽性的菌株，利用基因芯片技術進行INH、RFP耐藥突變檢測和分枝桿菌菌種鑒定，分析MDR與NTM感染的現況。

2. 分枝桿菌菌種鑒定：采用北京博奧生物(CapitalBio)生產的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(mycobacteria identification array kit)進行鑒定，該方法包含了17種分枝桿菌特異性的16s RNA探針(結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、不產色分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、金色分枝桿菌、土分枝桿菌、戈登分枝桿菌、草分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌、淺黃色分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、偶然分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌)，能明確待檢菌株是否為MTB和NTM，如果是NTM可進一步鑒定是否為前述的16種NTM之一[4-6]。實驗步驟簡述如下：用接種環從羅氏培養基收集菌株，加入核酸提取液，使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min，95 ℃水浴5 min，2348×g離心1 min，取上清液作為模板進行PCR，獲得熒光標記的PCR擴增產物，將PCR產物95 ℃裂解10 min，獲得的單鏈DNA置于冰水混合物中，與雜交緩沖液按比例混合，用微量移液器吹吸2次混勻，經蓋片的加樣孔加入雜交反應混合物，迅速蓋上雜交盒并密封后放入雜交儀中，計時120 min。雜交反應結束后，將雜交盒水平取出拆開，將芯片取出，用晶芯?SlideWasherTM8芯片洗干儀自動洗滌除去非特異性雜交的背景染色。然后于離心機中60×g離心5 min，甩干后掃描。使用LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀和相應軟件進行信號的讀取及結果判讀。

3. MTB的耐藥鑒定：采用北京博奧生物生產的結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒，該方法包含的RFP相關耐藥突變檢測位點有rpoB基因的 C531G、C531T、CG531AC、A526C、A526G、A526T、C526A、C526G、C526T、T533C、A516G、A516T、G516T、T511C、T511G、C513A、A513T、C522T；包含的INH相關耐藥檢測突變位點有katG基因的 G315A、G315C、G315T、C315及inhA基因的啟動子區(-15)C-T突變型[7]。實驗步驟同菌種鑒定。

三、統計學分析

利用SPSS 21.0 統計學軟件進行描述性統計分析。

結 果

1.分枝桿菌菌種鑒定結果：2803份菌株中，MTB有2598株，占92.7%。NTM有205株，占7.3%；前6位菌種：胞內分枝桿菌101株，堪薩斯分枝桿菌50株，龜-膿腫分枝桿菌24株，鳥分枝桿菌16株，偶然分枝桿菌4株，淺黃色分枝桿菌1株?；蛐酒瑱z測結果提示9株為NTM，但未能分型確定具體的菌種，結果見表1。

表1 2803株分枝桿菌的菌種鑒定情況

注a：為該菌種在所有NTM中所占比例

2. 耐藥菌株鑒定：2598株MTB中，對INH、RFP均敏感者有2173株，占83.6%；MDR菌株有173株，占6.7%；單耐INH者有171株，單耐RFP者有81株(表2)。

對MTB耐藥突變位點檢測的結果提示，katG315是INH耐藥的主要突變位點，與其相關的INH耐藥突變占81.1%(279/344)；rpoB531是RFP耐藥的主要突變位點，與其相關的RFP耐藥突變占61.0%(155/254)。254株耐RFP菌株的rpoB基

表2 2598株MTB對INH和RFP是否耐藥的檢測結果

因突變位點中，均為點突變，未見插入突變或缺失型突變；單位點突變 234例(92.1%)，雙位點突變 20 例(7.9% )；常見突變位點為rpoB531者占61.0%(155/254)、rpoB526者占14.2%(36/254)、rpoB516者占13.4%(34/254)、rpoB511者占12.6%(32/254)、rpoB533者占5.1%(13/254)、rpoB513者占1.6%(4/254)；MTB耐藥突變位點的分布情況見表3、4。

表3 254株耐RFP菌株的rpoB基因突變位點檢測結果

表4 344例耐INH菌株基因突變位點檢測結果

討 論

浙江省12個區(縣)收集到的2803份菌株中分離到NTM、MDR共378株，占總菌株的13.5%；這些菌株的感染者如按照經驗性使用國家推薦的標準方案(2H-R-Z-E/4H-R或2H2-R2-Z2-E2/4H2-R2)治療，效果是無效或是效果不佳的[8]。如果能在基層醫療機構及疾病預防控制中心采取分枝桿菌菌種鑒定，在診斷初期及時甄別NTM與MTB感染，可提高結核病診斷的正確性，及時獲得MDR感染信息并給予合理的治療；如此就有希望提高結核病患者的治愈率，對控制結核病疫情將有很好的促進作用。

浙江省的狀況在一定程度上反映了中國現階段結核病防控方面存在的問題?？h級醫療機構是中國結核病診治工作的主要承擔者，但目前有大部分的縣級醫療機構不具備對MTB進行分離培養的能力，更無法進行MTB耐藥檢測與分枝桿菌菌種鑒定；由這些機構診斷的肺結核患者中可能有一部分患者是NTM或MDR感染，在治的化療方案是不合理的[9]。中國是結核病高負擔國家，為加快結核病疫情的控制，中國有必要在所有承擔結核病診治任務的基層醫療機構規劃推行分枝桿菌菌種鑒定技術和耐藥檢測技術。

本研究顯示，擬診為肺結核的菌陽患者中，大約有7.3%的患者實際是NTM感染，我們應該高度重視NTM在結核病控制中的混雜干擾作用，避免誤診誤治，減少醫療浪費，減輕患者的經濟負擔。在浙江省，胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌是最常見的NTM流行菌種，與前期報道基本一致[10]。類似韓國、日本、臺灣[11-13]，關于這些NTM感染患者的治療與預防知識對于大部分臨床醫生還是很陌生的，加強知識的普及也是疾病防控工作中的重要環節[14]。

在MTB耐藥突變位點資料中，所有菌株中存在耐INH位點突變的菌株占12.5%，其中單耐INH的菌株為6.6%；所有菌株中存在耐RFP位點突變的菌種占9.8%，其中單耐RFP的菌株為3.1%；可見RFP耐藥位點突變后進一步轉化為MDR菌株的概率要高一些[15]，這些信息對結核病臨床工作中進行耐藥檢測靶點、耐藥預測的把握上有一定的參考價值。

[1] El Helou G，Viola GM，Hachem R，et al. Rapidly growing mycobacterial bloodstream infections. Lancet Infect Dis，2013，13(2)：166-174.

[2] Menzies D，Nahid P. Update in tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease 2012. Am J Respir Crit Care Med，2013，188(8)：923-927.

[3] 浙江省統計局,國家統計局浙江調查總隊.浙江省統計年鑒(2011).北京：中國統計出版社，2011.

[4] Zhu L，Jiang G，Wang S，et al. Biochip system for rapid and accurate identification of mycobacterial species from isolates and sputum. J Clin Microbiol，2010，48(10)：3654-3660.

[5] Pang Y，Zhou Y，Wang S，et al. Rapid molecular identification of mycobacterial species in positive culture isolates using the biochip test. Int J Tuberc Lung Dis，2011，15(12)：1680-1685.

[6] Liu J，Yue J，Yan Z，et al. Performance assessment of the CapitalBio mycobacterium identification array system for identification of mycobacteria. J Clin Microbiol，2012，50(1)：76-80.

[7] Guo Y，Zhou Y，Wang C，et al. Rapid and accurate determination of MDR inM.tuberculosisisolates and clinical sputum using a biochip system. Int J Tuberc Lung Dis，2009，13(7)：914-920.

[8] Zhao Y, Xu S，Wang L，et al.National survey of drug-resistant tuberculosis in China.N Engl J Med，2012,366(23):2161-2170.

[9] 全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組，全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室. 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告. 中國防癆雜志，2012，34(8)：485-508.

[10] Xu K，Bi S，Ji Z，et al. Distinguishing nontuberculous mycobacteria from multidrugr resistantMycobacteriumtuberculosis，China. Emerg Infect Dis，2014，20(6)：1060-1062.

[11] Ryoo SW，Shin S，Shim MS，et al. Spread of nontuberculous mycobacteria from 1993 to 2006 in Koreans. J Clin Lab Anal，2008，22(6)：415-420.

[12] Tsukamura M，Kita N，Shimoide H，et al. Studies on the nontuberculous lung mycobacteriosis in Japan. Kekkaku，1988，63(7)：493-499.

[13] Chiang CY，Luh KT，Enarson DA，et al. Accuracy of classification of notified tuberculosis cases in Taiwan. Int J Tuberc Lung Dis，2007，11(8)：876-881.

[14] McGrath EE，McCabe J，Anderson PB. Guidelines on the diagnosis and treatment of pulmonary non-tuberculous mycobacteria infection. Int J Clin Pract，2008，62(12)：1947-1955.

[15] Zumla AI，Gillespie SH，Hoelscher M，et al. New antituberculosis drugs，regimens，and adjunct therapies： needs，advances，and future prospects. Lancet Infect Dis，2014，14(4)：327-340.

(本文編輯：范永德)

Strain identification and analysis of drug resistance gene characteristics inM.tuberculosisstrains from 12 districts in Zhejiang Province

XUKai-jin，JIZhong-kang，HUHai-yang，BISheng，HUFei-shu，ZHENGLin，JINXiu-yuan，XUWen-jie，WANGShu-ting,YANGMei-fang，SHAOJun-dan,LIPeng-cheng,HUANGYan-fang，SHENGJi-fang，LILan-juan.

StateKeyLaboratoryforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases，theFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China

LILan-juan,Email:ljli@zju.edu.cn

Objective To analyze the epidemiological characteristics of Mycobacterium strains and drug-resistance gene characteristics inMycobacteriumtuberculosisstrains from 12 counties in Zhejiang Province, China. Methods From January, 2012, to June, 2016, a total of 2803 sputum positive samples (positive staining that confirmed growth of acid-fast bacilli) were collected from patients newly diagnosed with TB in Zhejiang Province. Mycobacteria Identification Array Kits andM.tuberculosisDrug Resistance Detection Array Kits were used to further identify and characterize the strains in each sample. Results We identified 2598 of the 2803 strains (92.7%), asMycobacteriumtuberculosisand 205 strains (7.3%) as NTM. NTM strains were further identified as follows:Mycobacteriumintracellulare, 101 isolates;Mycobacteriumkansasii, 50 isolates; Turtle/Mycobacteriumabscessus, 24 isolates;Mycobacteriumavium, 16 isolates;Mycobacteriumfortuitum, 4 isolates；light yellowMycobacterium,1 isolate. Among the 2598M.tuberculosisstrains there were 326 (12.5%) INH-resistant strains, 254 (9.8%) RFP-resistant strains，and 173 (6.7%) MDR TB strains. Among the drug-resistant strains ofM.tuberculosis, 81.1% (279/344) of the INH-resistant mutations were related tokatG315, and 84 (60.0%) of 140 RFP-resistant mutations were associated withrpoB531. Conclusion Among the 2803 strains collected from patients in 12 counties of Zhejiang Province, 378 (13.5%) were designated as either MDR TB or NTM. In addition,katG315 was the main point mutation associated with INH resistance inM.tuberculosisstrains, andrpoB531 was the main point mutation for RFP resistance. Mycobacterium strain identification and drug-resistance testing are important in enhancing regulation and prevention of TB in basic medical institutions.

Mycobacteriumtuberculosis； Mycobacteria, atypical； Drug resistance, multiple, bacterial； Genes, MDR； Point mutation； Data interpretation, statistics

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.010

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10004-904；2014ZX10003002)；浙江省衛生和計劃生育委員會醫藥衛生科技計劃項目(2015KYA102)

310003 杭州，浙江大學醫學院附屬第一醫院 傳染病診治國家重點實驗室 感染性疾病診治協同創新中心

李蘭娟，Email：ljli@zju.edu.cn

2016-08-22)