結核分枝桿菌在不同pH值液體培養基中對吡嗪酰胺敏感度的研究

鄭惠文 逄宇 趙雁林

·論著·

結核分枝桿菌在不同pH值液體培養基中對吡嗪酰胺敏感度的研究

鄭惠文 逄宇 趙雁林

目的 研究結核分枝桿菌在不同pH值液體培養基中對吡嗪酰胺(PZA)敏感度的影響，同時比較不同pH值下結核分枝桿菌對吡嗪酰胺的敏感度與測序結果的一致率，探討最適合對吡嗪酰胺進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)的pH值。方法 本研究采用簡單隨機抽樣法中的直接抽選法，從2007年全國結核病耐藥性基線調查的3929株結核分枝桿菌菌株中抽取348株；采用BACTEC MGIT 960系統在液體培養基pH值為 5.3、5.5、5.7、5.9和6.1時，分別檢測結核分枝桿菌對吡嗪酰胺的敏感度；同時對吡嗪酰胺耐藥的結核分枝桿菌相關基因pncA和rpsA進行測序，分析其突變特征；采用卡方檢驗統計2種方法檢測吡嗪酰胺耐藥率的差別，以P<0.05為差異有統計學意義。結果 在348株結核分枝桿菌中，用MGITTM960 PZA試劑盒(pH值為5.9)檢測的吡嗪酰胺總耐藥率為14.4% (50/348)，DNA測序結果有43株耐藥，其中有30(69.8%)株檢測到吡嗪酰胺藥物耐藥相關基因pncA發生突變， 1株(2.3%)耐藥分離株僅在rpsA有突變。在液體培養基pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時，DNA測序結果與所有菌株表型藥敏試驗結果的一致率分別為94.8% (330/348)、95.1% (331/348)、 96.8% (337/348)、 95.2% (316/332) 和 93.5% (287/307)。并且pH值為5.7時2種方法的耐藥一致率(92.1%，35/38)明顯高于pH值為5.9(76.0%， 38/50)時(χ2=3.961,P=0.047)；而pH值為6.1 (72.7%，40/55)、pH值為5.5(93.3%，28/30)和pH值為5.3(95.0%， 19/20)時的耐藥一致率與pH值為5.9時的耐藥一致率相比，差異無統計學意義(χ2=0.147,P=0.702；χ2=0.366,P=0.545；χ2=3.410,P=0.065)。結論 液體培養基pH值為5.7時，結核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥與遺傳突變檢測結果有較好的相關性。

分枝桿菌，結核； 吡嗪酰胺； 培養基, 條件性； DNA突變分析； 抗藥性； 判別分析

結核病是全世界重要的公共衛生問題之一。據WHO估計，2015年全球約有104萬例新發結核病患者，140萬例死于結核病，中國的新發結核病患者例數僅次于印度和印度尼西亞而位居全球第三位[1]。吡嗪酰胺(PZA)是重要的一線抗結核藥物，可在酸性環境中殺死半休眠狀態的結核分枝桿菌，使化療療程從既往的9～12個月縮短至6個月[2]。在酸性環境中(pH=5.5)，PZA能夠轉化為吡嗪酸(pyrozinoic acid，POA)，發揮殺菌活性[3]。WHO 推薦采用BACTEC MGIT 960系統(簡稱“MGIT 960系統”)在酸性環境中(pH=5.9)檢測結核分枝桿菌對PZA的敏感度[4]，但不同的pH值將影響吡嗪酰胺酶(pyrazanamidase, PZase)的活性，從而可能對結核分枝桿菌產生不同的抑制作用。此外，編碼吡嗪酰胺酶的基因pncA和編碼核糖體蛋白質S1的基因rpsA突變也與結核分枝桿菌PZA耐藥有關[5]。因此，筆者采用MGIT 960系統，檢測液體培養基不同pH值情況下結核分枝桿菌對PZA敏感度的影響，并與DNA測序表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結果進行比較，探討最適合進行PZA藥敏試驗的液體培養基pH值。

材料和方法

一、菌株來源

本實驗采用簡單隨機抽樣法中的直接抽選法，從3929株來自于2007年全國結核病耐藥性基線調查的菌株中抽取348株，菌株由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供。348株菌株經對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)菌種鑒定實驗證實為結核分枝桿菌復合群(MTBC)。

二、試劑來源

本實驗所用改良羅氏培養基購于珠海貝索生物技術有限公司； MGITTM960 PZA試劑盒購于美國BD公司(貨號245128，批號4199861，效期2016年11月26日)；2×Taq 預混液購自北京康為世紀生物科技有限公司；所有引物均由北京擎科生物技術有限公司合成。

三、PZA藥敏試驗

采用WHO推薦的MGIT 960系統進行藥敏試驗。將結核分枝桿菌陽性培養物制備成1 mg/ml 菌懸液，稀釋至106菌落形成單位(CFU)/ml，取0.5 ml菌懸液加入進行PZA藥敏試驗專用的MGIT培養管中(藥物濃度100 μg/ml)，將菌懸液1∶10稀釋后加入不含PZA的培養管中，作為生長對照管。采用結核分枝桿菌標準菌株H37Rv(ATCC 27249)作為質控菌株。此外，用磷酸將液體培養基的pH值 (5.9)調節到5.3、5.5和5.7，用碳酸氫鈉將液體培養基pH值調到6.1。液體培養基的pH值用pH計進行檢測。然后置于MGIT 960系統中，根據分枝桿菌生長情況比對自動報告藥物敏感度結果。

四、基因組DNA提取

采用簡單水煮法提取MTB基因組DNA，使用接種環從改良羅氏培養基斜面刮取MTB菌落，將菌落轉移至含有1 ml生理鹽水的無菌Eppendorf 離心管中，85 ℃ 30 min滅活，12 000×g離心5 min，棄上清。菌體用500 μl TE (Tris-EDTA) 緩沖液(pH=8.0)充分懸浮，100 ℃沸水浴30 min，12 000×g離心5 min，將上清轉移至無菌離心管中用于基因擴增模板。

五、基因擴增和測序

擴增對PZA耐藥的相關基因pncA和rpsA， 引物序列分別為F1，5′-TGCCACTCGCCGGTAACCGG-3；F2，5′-GGTGGCCGCCGCTCAGCTGG-3′，用于擴增pncA全基因；F3，5′-GGCCGCAGCTG-GGACGCGGC-3′； F4， 5′-CGGTCCAGCGCTCC-GTCTGC-3′，用于擴增rpsA全基因。擴增體系如下：2×Taq 預混液25 μl， 上游引物0.2 μmol， 下游引物0.2 μmol，基因組DNA 5 μl，使用雙蒸水(ddH2O)補平到總體積50 μl。PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min， 58 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min， 35個循環；72 ℃延伸10 min。基因擴增產物送北京擎科生物技術有限公司測序。測序結果采用BioEdit 軟件與標準株H37Rv基因序列進行比對。

六、統計學分析

采用SPSS 11.5 軟件進行統計學分析，藥物敏感性結果與測序結果一致率之間的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、pncA和rpsA突變結果分析

348株MTBC中，220株(63.2%)為敏感株，128株(36.8%)為耐藥菌株，其中MDR 33株，XDR 2株(表1)。MGITTM960 PZA試劑盒(pH=5.9)檢測的50株PZA耐藥株中，測序結果有43株耐藥，其中30株pncA發生突變，突變率達69.8%(30/43)。其中23株(76.7%)為氨基酸替換突變，6株(20.0%)為堿基插入或缺失引起的氨基酸移碼突變，1株(1/30)在啟動子區-11位堿基發生A→C突變。除了pncA基因外，1株(2.3%)PZA耐藥分離株僅在rpsA有突變。此外，1株PZA敏感株分別在pncA的40位密碼子和rpsA的497位密碼子檢測出突變(表2)。

表1 不同耐藥類型在348株結核分枝桿菌分離菌株中的分布及耐藥率

注 H：異煙肼；R：利福平；E：乙胺丁醇；S：鏈霉素；Ofx：氧氟沙星；Km：卡那霉素；MDR：耐多藥；XDR：廣泛耐藥

二、不同pH值液體培養基的藥敏試驗結果比較

在液體培養基的pH值為5.5和5.3時，分別有16株(4.6%)和41株(11.8%)在對照管中沒有生長。在液體培養基的pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時，PZA表型耐藥分離株分別占有藥敏試驗結果菌株的15.8% (55/348)、14.4% (50/348)、10.9% (38/348)、9.0%(30/332)和6.5%(20/307)。統計學分析表明，表型耐藥與基因型耐藥的一致率在培養基的pH值為 5.9時和pH值為6.1時分別為76.0% (38/50)、72.7% (40/55)，差異無統計學

表2 對PZA耐藥結核分枝桿菌的pncA和rpsA基因突變情況

注a：啟動子區無氨基酸變化

意義(χ2=0.147,P=0.702)。在培養基的pH值為 5.7時，表型耐藥與基因型耐藥藥敏試驗結果的一致率明顯高于pH值為 5.9時，耐藥一致率分別為92.1% (35/38)、76.0%(38/50)，差異具有統計學意義(χ2=3.961,P=0.047)。同樣，pH 值為5.5時的耐藥一致率(93.3%)明顯高于pH值為 5.9時，差異具有統計學意義(χ2=3.902,P=0.048)。與DNA測序結果相比，表型藥敏試驗結果的一致率在pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時分別為94.8%(330/348)、95.1%(331/348)、 96.8%(337/348)、 95.2%(316/332) 和 93.5%(287/307)，并且在pH值為5.9時的一致率明顯低于pH值為5.7時，差異具有統計學意義(χ2=5.441,P=0.020)(表3)。

表3 對PZA進行表型藥敏試驗的結果與pncA或rpsA基因突變測序結果的一致率

注 一致率以表型藥敏試驗結果作為標準

討 論

PZA可以殺死半休眠狀態的結核分枝桿菌，是結核病短程化療方案的重要組成藥物。研究發現，PZA只有在體外酸性環境中或巨噬細胞中才能發揮抗結核分枝桿菌作用，它進入體內后，通過吡嗪酰胺酶轉化為吡嗪酸實現殺菌作用。然而由于PZA體外實驗對培養條件的特殊要求，改良羅氏培養法尚不能檢測PZA耐藥性[6]。MGIT 960系統是WHO推薦的液體藥敏試驗檢測系統，在液體培養基pH值為5.9時可用于對PZA的體外敏感度檢測，但該酸度并不能使吡嗪酰胺酶的活性發揮最大，超過10%的分枝桿菌在pH值為5.5時不能生長，而此時PZA在體外的活性最大[7-8]。因此，尋找適合細菌生長和酶活性的pH值至關重要。筆者研究發現液體培養基酸度越大，對PZA耐藥的比例越低。說明低pH值更有利于吡嗪酰胺酶發揮活性，將PZA轉化為吡嗪酸，從而抑制結核分枝桿菌生長。研究表明，部分菌株、尤其是PZA耐藥菌株在pH值低于5.5的酸性環境中不能生長[9]。與之前研究類似[9-10]，筆者發現在pH值為5.3時，11.8%的結核分枝桿菌不能生長；而pH高于5.7時，結核分枝桿菌的生長并未受到抑制，表明該pH值是結核分枝桿菌存活的上限。

結核分枝桿菌編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因發生突變，導致該酶活性下降，是結核分枝桿菌對PZA耐藥的主要原因[11]。Chang等[12]分析表明，平均87%的對PZA耐藥的菌株中pncA基因發生突變。而本研究中只有69.8%的對PZA耐藥的菌株出現pncA突變，與國外報道的69%～98.8%突變率相似[13-15]。這種不同可能是由于MGIT960系統本身造成的假陽性結果，包括培養基的pH值、抗生素濃度和接種量[16]。當培養基的pH值調到5.7時，MGIT 960系統檢測的結核分枝桿菌對PZA的耐藥與基因測序有較好的相關性。由于pH值為 5.9時，MGIT 960檢測系統可能產生較多的假陽性PZA耐藥株，因此將培養基的pH值降到理想的水平是至關重要的。

綜上所述，遺傳突變與液體培養基pH 值為5.7時的PZA耐藥有較好的相關性。在對PZA進行體外藥敏試驗中，液體培養基pH 值為5.7或許是調節吡嗪酰胺酶活性和結核分枝桿菌生長的理想閾值。

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(本文編輯：范永德)

The effect of pH on the pyrazinamide susceptibility ofMycobacteriumtuberculosis

ZHENGHui-wen*,PANGYu,ZHAOYan-lin.

*NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the effect of pH on the pyrazinamide (PZA) susceptibility ofMycobac-teriumtuberculosisstrains in the BACTEC MGIT 960 liquid medium, to demonstrate the relationship between phenotype susceptibility and genetic changes amongM.tuberculosisisolates, and to determine the most suitable pH value for evaluating pyrazinamide susceptibility. Methods A total of 348 isolates were randomly selected from those collected during the national drug resistance baseline survey conducted in 2007, and the PZA susceptibility of eachM.tuberculosisisolate was detected using the BACTEC MGIT 960 automated system at pH 5.3, 5.5, 5.7, 5.9 and 6.1. ThepncAandrpsAgenes from all isolates were sequenced for genetic mutations conferring PZA resistance. The concordance rate between phenotypic DST in different pH environments and genetic changes was evaluated using the Chi-square test,P<0.05 being considered statistically significant. Results Of the 348M.tuberculosisisolates, 50 (14.4%) isolates resistant to PZA were detected using a commercial BACTEC MGIT 960 PZA kit at pH 5.9, and 43 using DNA sequencing, 30 (69.8%) isolates harboringpncAmutations, and 1 (2.3%) isolate harboring mutations only inrpsA. The overall concordance rate between DNA sequencing and phenotypic DST results at different pH values was 94.8% (330/348), 95.1% (331/348), 96.8% (337/348), 95.2% (316/332) and 93.5% (287/307) at pH 6.1, pH 5.9, pH 5.7, pH 5.5 and pH 5.3, respectively. The difference between the pH 5.9 and pH 5.7 groups was statistically significant (χ2=3.961,P=0.047), but that between the pH 6.1, pH 5.5, pH 5.3 and pH 5.9 groups (χ2=0.147,P=0.702；χ2=0.366,P=0.545；χ2=3.410,P=0.065, respectively) was not statistically significant. Conclusion The strongest correlation between genetic changes inM.tuberculosisisolates and PZA resistance was obtained using liquid culture at pH 5.7. Using a pH 5.7 liquid medium may be the best approach to resolve the dilemma between PZase activity and mycobacterial growth during PZA susceptibility testing.

Mycobacteriumtuberculosis; Pyrazinamide; Culture media, conditioned; DNA mutational analysis; Drug resistance; Discriminant analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.009

“十二五”國家科技重大專項(2014ZX100030002)

102206 北京，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所(鄭惠文),結核病預防控制中心(逄宇、趙雁林)

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-11-21)