免疫輔助治療初治肺結核的研究

何婭 潘洪秋 范琳

·論著·

免疫輔助治療初治肺結核的研究

何婭 潘洪秋 范琳

目的 評估免疫輔助治療初治肺結核的療效并探討使用適應證。方法 回顧性研究2014年1月至2015年12月上海市肺科醫院收治的246例初治肺結核患者。以CD4+/CD8+比值及是否進行免疫輔助治療(強化期連續注射外源性母牛分枝桿菌菌苗免疫制劑)，將患者分為“CD4+/CD8+≥1+輔以免疫治療”組(簡稱“A1”組，64例)、“CD4+/CD8+≥1+非免疫治療”組(簡稱“A2”組，61例)、“CD4+/CD8+<1+輔以免疫治療”組(簡稱“B1”組，65例)、“CD4+/CD8+<1+非免疫治療”組(簡稱“B2”組，56例)，并且隨訪、比較4個組患者的療效。結果 CD4+/CD8+<1的患者，治療2個月末病灶吸收的有效率B1組[80.0%(52/65)]高于B2組[55.4%(31/56)]，差異有統計學意義(χ2=8.48，P=0.006)； B1組較B2組患者在并發肺外結核[84.2%(32/38)，50.0%(16/32)]、涂陽肺結核[83.3%(25/30)，47.8%(11/23)]、無并發癥[82.9%(34/41)，52.8%(19/36)]及廣泛病灶[76.9%(40/52)，52.5%(21/40)]方面差異均有統計學意義(χ2=9.43，P=0.002；χ2=7.53，P=0.006；χ2=8.12，P=0.004；χ2=6.04，P=0.016)。A1組CD4+/CD8+比值治療后(1.87±0.78)較治療前(2.19±0.94)降低，差異有統計學意義(t=3.39，P=0.001)； B1組及B2組CD4+/CD8+比值治療后(1.12±0.53；1.27±0.76)較治療前(0.79±0.34；0.87±0.49)升高，差異均有統計學意義(t=4.88,P=0.001；t=3.98，P=0.001)。結論 對于初治肺結核可以將CD4+/CD8+=1作為給予免疫治療的適應證指標，當CD4+/CD8+<1時，對于涂陽肺結核、無并發癥肺結核、肺部病灶廣泛、并發肺外結核的患者給予免疫輔助治療，可加快病灶的吸收。

結核； 肺； 免疫療法； 主動； 治療結果； 數據說明； 統計分析； 療效比較研究

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的以侵犯肺臟為主的傳染病，嚴重威脅人類健康。結核病患者的轉歸與宿主細胞免疫功能密切相關，當MTB侵入機體后，可引起以細胞免疫為主的免疫應答，而機體細胞免疫功能狀態可以用T細胞及其亞群含量來衡量，CD4+/CD8+比值可很好地反映宿主免疫調節平衡[1]，已被作為最常用的評價機體免疫狀態的指標。Bold和Ernst[2]研究顯示，結核病患者體內CD8+T細胞的功能依賴于CD4+T細胞的功能，且兩群細胞的比值較健康者明顯降低，下降程度也與病情的嚴重程度呈正相關。故可認為，抗結核化療的同時給予正確的免疫治療能提高抗結核藥物治療的效果,但目前缺乏使用免疫制劑的適應證。本研究對上海市肺科醫院初治肺結核患者進行回顧性分析，觀察在不同CD4+/CD8+比值下，接受抗結核化療聯合使用免疫輔助治療的臨床療效。

資料和方法

一、研究資料

1. 研究對象：對上海市肺科醫院2014年1月至2015年12月住院的246例初治肺結核患者進行回顧性研究，其中男149例(60.6%)，女97例(39.4%)，年齡17～85歲，平均(43.35±17.96)歲，并發肺外結核142例、其他并發疾病(糖尿病23例、肝功能異常20例、低蛋白血癥10例、慢性阻塞性肺病13例、白細胞減少4例、塵肺3例、藥物過敏3例、產褥期4例、胃炎3例、腎結石3例)患者86例、肺部廣泛病灶者178例。以CD4+/CD8+比值及是否進行免疫輔助治療將患者分為CD4+/CD8+≥1+輔以免疫治療組(簡稱“A1組”，64例)、CD4+/CD8+≥1+非免疫治療組(簡稱“A2組”，61例)、CD4+/CD8+<1+輔以免疫治療組(簡稱“B1組”，65例)、CD4+/CD8+<1+非免疫治療組(簡稱“B2組”，56例)。以上4個組患者性別、年齡、并發癥的差異均無統計學意義(χ2=5.84，P=0.119；F=0.05，P=0.984；χ2=28.40，P=0.551)，見表1。

2.患者入選及排除標準：(1)入選標準：入選患者符合《肺結核診斷和治療指南》[3]的初治肺結核診斷標準。(2)排除標準：①非初治肺結核患者；②初治肺結核化療超過2周的患者；③經藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)證實為耐藥的初治肺結核患者；④ 初治肺結核并發妊娠和嚴重心、肝、腎臟疾病，并發HIV感染和其他免疫性疾病；⑤近3個月使用過任何調節免疫功能藥物的患者。

表1 各組患者的性別、年齡、主要并發癥分布情況

注 其他并發癥包括：藥物過敏、產褥期、胃炎、腎結石

二、研究方法

1.外周血采樣及主要儀器和試劑：采集所有患者抗結核化療前及治療后6個月末清晨空腹靜脈血，經乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)抗凝后送檢(標本量2 ml)。采用Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)檢測血中自然殺傷(natural killer,NK)細胞和自然殺傷T(natural killer T,NKT)細胞和T細胞亞群，計數CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞。

2. CD4+/CD8+比值：正常比值參考范圍為“1.54±0.59”，95%的正常人CD4+/CD8+比值都在“1”以上，本研究以CD4+/CD8+的參考值下限近似值 “1”作為分組參考標準。

3.治療方案：所有患者均給予標準初治抗結核藥物治療方案2H-R-E-Z/4H-R，并發肺外結核者延長鞏固期治療至總療程12個月。A1組和B1組強化期均給予連續2個月的外源性注射類免疫調節治療。免疫制劑為母牛分枝桿菌菌苗(M．vaccae，微卡；安徽龍科馬生物制藥有限公司生產；生產批號：20131120；國藥準字：S2001003)22.5 μg/次，1次/周，肌內注射。

4. 觀察項目及療效判定：所有涂陽患者在治療5、6個月末行痰涂片熒光染色，以連續2個月痰涂片陰性且不再復陽為陰轉。于治療2個月末及6個月末行胸部X線攝影檢查，以胸片所有病灶相加后占所有的肺野數來計算病變范圍，并且作為療效判定標準。(1)病灶變化標準：明顯吸收(病灶吸收≥1/2)，吸收(病灶吸收<1/2)，不變(病灶無明顯變化)，惡化(病灶擴大或播散)；病灶有效(顯吸+吸收)，病灶無效(不變+惡化)；(2)空洞變化標準：閉合，縮小(空洞縮小≥原空洞直徑1/2)，不變(空洞縮小或增大<原空洞直徑1/2)，增大(空洞增大>原空洞直徑1/2)；空洞有效(閉合+縮小)，空洞無效(不變+增大)；(3)病變范圍：廣泛病灶(病灶累及肺野≥3個)。

三、統計學分析

應用SPSS 17.0軟件對所有數據進行統計學處理，計數資料“率”的比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法, 計量資料采用方差分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、抗結核治療后的影像學改變

1.患者在治療2個月末的病灶有效吸收情況：A1組與A2組間差異無統計學意義(χ2=0.35，P=0.851)，B1組療效明顯優于B2組(χ2=8.48，P=0.006)，見表2。CD4+/CD8+<1組并發肺外結核、涂陽肺結核、無并發癥及廣泛病灶的患者B1組優于B2組(χ2=9.43，χ2=7.53，χ2=8.12，χ2=6.04，P值均<0.05)，見表3。

2.患者在治療6個月末病灶吸收有效率：A1組與A2組(χ2=0.02，P=0.880)、B1組與B2組(χ2=1.21，P=0.272)差異均無統計學意義，見表4。

3.患者在2、6個月末并發空洞者病灶吸收情況：2、6個月末A1組較A2組(χ2=0.01，χ2=2.14，P值均>0.05)，B1組較B2組(χ2=2.13，χ2=0.13，P值均>0.05)差異均無統計學意義，見表5。

二、患者在治療后5、6個月末痰涂片陰轉率的比較

A1組與A2組比較(χ2=0.03，P=0.867)；B1組與B2組比較(χ2=0.01，P=0.912)，差異均無統計學意義，見表6。

三、各組患者治療前后CD4+/CD8+比值的變化情況

A1組CD4+/CD8+比值治療后較治療前下降，差異有統計學意義(t=3.39,P=0.001)；A2組治療后較治療前差異無統計學意義(t=0.09，P=0.926)；B1組及B2組CD4+/CD8+比值治療后較治療前均增高,差異均有統計學意義(t=4.88，t=3.98，P值均=0.001)。治療后B1組及B2組間CD4+/CD8+比值差異無統計學意義(t=1.25，P=0.213)，見表7。

表2 各組患者在治療后2個月末病灶有效吸收率的比較

注 有效：明顯吸收+吸收；a:A1組與A2組比較;b:B1組與B2組比較

表3 CD4+/CD8+<1的患者類型在治療2個月末病灶吸收有效率的比較

注 有效：明顯吸收+吸收

表4 各組患者在治療后6個月末病灶吸收有效率的比較

注a：A1與A2組比較；b：B1與B2組比較

表5 各組患者在治療后2、6個月末空洞吸收有效率的比較

注a：2個月末A1組與A2比較；b：6個月末A1組與A2比較；c：2個月末B1組與B2比較；d：6個月末B1組與B2比較

表6 各組患者在治療后5、6個月末痰菌陰轉率的比較

注a：A1與A2組比較；b：B1與B2組比較

表7 各組患者治療前后CD4+/CD8+比值變化情況

討 論

一、結核病的免疫反應特征

進入21世紀后，由于HIV感染、免疫抑制劑的廣泛使用、耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的出現，結核病的發病率逐年升高，臨床治療面臨極大的困難[4]。MTB引起的保護性免疫反應主要是T細胞輔助細胞(Th1細胞)介導的細胞免疫反應。CD4+細胞在細胞免疫中起重要作用。其可分泌多種細胞因子(cytokines,CK)，激活巨噬細胞，參與結核病免疫反應。CD4+細胞根據其分泌CK的不同分為Thl和Th2細胞。Thl細胞促進細胞免疫，消除感染源。Th2細胞抑制Thl介導的保護性免疫應答。Thl/Th2應答失衡是結核病發生、發展的重要機制[5-6]。結核病的發生發展是免疫應答失衡的疾病過程，CD4+、CD8+細胞的數量和功能與其疾病演變密切相關。對于結核病患者T淋巴細胞亞群的變化，目前認為存在CD4+T細胞下降、CD8+T細胞增多，CD4+/CD8+比值下降甚至倒置是結核病患者免疫受損的最主要表現[7]。輔助免疫治療主要通過促進Th1型免疫應答反應及其細胞因子的產生，刺激機體保護性免疫應答，以改善臨床癥狀、縮短化療療程，減少機體組織的病理損傷[8]。因此，輔以免疫制劑治療可能會改變T細胞數量及功能失調的狀態，達到促進療效的目的，并成為結核病綜合治療的方法之一。在抗結核新藥的研發相對滯后于疫情控制需求的局面下，對如何正確、有效地使用現有免疫制劑提出了要求，即如何通過現有的檢測手段有選擇地篩選出真正需要免疫治療的結核病患者。

二、結核病的免疫治療適應證

目前，報道的大多數研究是以免疫指標的變化來衡量免疫治療的效果，而對于哪些結核病患者需要輔助免疫治療沒有給出更好的參考標準。本研究則采用國內較為普及的流式細胞儀檢測CD4+/CD8+比值，以其參考值下限近似值“1”為節點，來判斷以CD4+/CD8+比值的變化能否成為給予肺結核患者免疫治療的適應證之一。本研究結果顯示，在2個月末病灶吸收情況比較中，CD4+/CD8+<1(即B1組及B2組)的患者中給予免疫治療與不予免疫治療的比較差異有統計學意義(χ2=8.48，P<0.01)；且并發肺外結核、涂陽肺結核、無并發癥肺結核、廣泛病灶的患者，B1組均優于B2組(χ2=9.43，χ2=7.53，χ2=8.12，χ2=6.04，P值均<0.05)。以上結果與2011年Yang等[9]進行的一項薈萃分析所報道的微卡輔助化療可改善影像學表現的結論相符。但對于6個月末病灶療效差異無統計學意義，說明當CD4+/CD8+<1時，對于涂陽肺結核患者、并發肺外結核、無并發癥肺結核、廣泛病灶肺結核患者給予早期合理的免疫輔助治療，可加快強化期病灶的吸收，并取得較好療效。

本研究結果還顯示，B1組及B2組CD4+/CD8+比值通過治療后均增高,差異有統計學意義(t=4.88,t=3.98，P值均<0.01)，治療后B1組及B2組之間的比較CD4+/CD8+比值差異無統計學意義(t=1.25,P>0.05)，與吳碧彤等[10]報道的結果一致。說明對于CD4+/CD8+<1者合適的治療更易使得細胞免疫水平得到提高；但輔以免疫治療會提高患者早期療效，且相較于2個月末病灶療效，同時進行2個月末的CD4+/CD8+檢測可能會更有意義。而A1組及A2組的CD4+/CD8+比值卻沒有得到提升，說明對于CD4+/CD8+>1患者治療效果與是否輔以免疫治療無相關性，故CD4+/CD8+>1的初治肺結核患者可不必給予微卡等免疫治療。也進一步說明CD4+/CD8+=1可以作為是否給予免疫治療的驗證界值，筆者認為具有一定的指導意義，為今后有針對性地選擇患者進行有效的免疫治療提供了免疫指標量化的參考標準。

本研究結果顯示，各組在治療后5、6個月末痰涂片陰轉率差異無統計學意義，除了上述原因，還可能與隨訪中患者取痰送檢質量和樣本量較少有關；對于并發空洞的患者，在治療后2、6個月末空洞病灶吸收率各組差異無統計學意義，可能與空洞的吸收和閉合是一個較長的修復過程，本研究觀察時間比較短有關。對于結核病痰菌涂陽陰轉率、療程中遠期病灶吸收療效、根治效果和防止結核病遠期復發的確切效果，未來需要在多中心、大樣本、遠期隨訪的研究中進一步闡明。此外，本研究對于MDR-TB、有并發癥的肺結核患者的免疫治療效果評價也未能分辨，將有待針對特定患者進行臨床考評。

三、結核病免疫制劑的選擇

結核病的免疫治療制劑有母牛分枝桿菌菌苗、多種細胞因子[γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-12、腫瘤壞死因子-α，等等]、結核DNA疫苗、卡介苗等[5]。目前，較為常用的是母牛分枝桿菌菌苗(M．vaccae，微卡)，其為注射類藥物，是1964年Benicke等首次從牛乳腺中分離到的一種快生長非結核分枝桿菌(NTM)，對人畜無致病性；WHO在制定20世紀90年代結核病研究與發展戰略規劃中，提出結核病化學療法與免疫療法相結合，母牛分枝桿菌菌苗是惟一被推薦的免疫治療制劑，并有報道推薦微卡作為結核病的常規輔助治療制劑[11-12]，這也是本研究采用的免疫治療藥物。微卡的作用機制包括，提高巨噬細胞產生自由基NO、H2O2的能力，明顯增強機體內T淋巴細胞和自然殺傷細胞功能，激活T細胞釋放各種淋巴因子，提高IL-2、IL-12受體的表達和IFN-γ的誘生水平；并且微卡具有雙向免疫調節功能，對免疫功能低下和亢進者均有調節和治療作用，可使CD3+和CD4+值增高、CD8+值降低；還具有改善細胞免疫功能、抑制變態反應、減輕病理損傷的特性，已廣泛用于結核病的免疫治療。本研究以CD4+/CD8+=1為界限決定對初治肺結核是否采用微卡進行免疫治療，結果表明患者CD4+/CD8+比值<1是進行免疫治療的適應證，>1者不必進行免疫治療。 B1組較B2組在促進CD4+/CD8+增高的同時也獲得了較好的2個月末療效，并進一步分析當CD4+/CD8+<1時并發肺外結核、涂陽肺結核、無并發癥、廣泛結核病灶時強化期輔以免疫治療可取得較好的早期療效，顯示對于相對重癥的結核病患者早期的免疫干預對于病灶吸收有積極的促進作用。這也符合近期發表的一篇綜述中指出的微卡對初治及復治肺結核具有肯定的治療作用[13]。有研究證實加微卡進行免疫輔助治療可加快治療后2個月末患者痰菌陰轉、病灶吸收及空洞縮小、閉合的速度，縮短短程化療療程，提高聯合化療的療效。但是針對微卡的研究報道局限于一些小樣本的研究，對其使用的確切適應證還缺乏嚴格的論證基礎[14]。而對于其他免疫制劑，是否以CD4+/CD8+=1為參考標準進行免疫治療需要在今后的研究中得到進一步驗證。

綜上所述，初治肺結核CD4+/CD8+比值“1”可作為給予免疫治療的標準，>1可不必給予免疫治療，<1且并發肺部病灶廣泛、涂陽肺結核、肺外結核者應早期輔以免疫治療，可加快治療初期病灶吸收。結核病化療和免疫治療相輔相成，不可偏倚，也不能盲目；為避免過度治療，選擇以上指標作為免疫治療的適應證，可以取得最大的收益。

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(本文編輯：孟莉 范永德)

Analysis of immune adjuvant therapy for the initial treatment pulmonary tuberculosis

HEYa,PANHong-qiu,FANLin*.

*TuberculosisClinicalResearchCenterofShanghaiPulmonaryHospitalaffiliatedtoTongjiUniversity,ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis(Lung),Shanghai200433,China

FANLin,Email:fanlinsj@163.com

Objective To evaluate the efficacy of adjuvant therapy for pulmonary tuberculosis, and explore its clinical indications. Methods Data from 246 patients with pulmonary tuberculosis collected from January 2014 to December 2015 was analyzed retrospectively. Patients were divided into groups according to the CD4+/CD8+ratios and use of immunoadjuvant therapy (continuous injection of exogenous Mycobacterium vaccine immune agents during the intensive treatment period): CD4+/CD8+≥1 with immunoadjuvant therapy (A1 group, 64 cases), CD4+/CD8+≥1 without immunoadjuvant therapy (A2 group, 61 cases), CD4+/CD8+<1 with immunoadjuvant therapy (B1 group, 65 cases), and CD4+/CD8+<1 without immunoadjuvant therapy (B2 group, 56 cases), and the efficacy of anti-TB treatment in the four groups was followed up. Results After treatment for two months, the efficacy for patients with CD4+/CD8+<1 in the B1 group (80.0% (52/65)) was better than that in the B2 group (55.4% (31/56)), and the difference was statistically significant (χ2=8.48,P=0.006). The difference in concurrent extrapulmonary tuberculosis (84.2% (32/38), 50.0% (16/32)), Smear-positive pulmonary tuberculosis (83.3% (25/30), 47.8% (11/23)), no complications (82.9% (34/41), 52.8% (19/36)), and extensive lesions (76.9% (40/52), 52.5% (21/40)) was statistically significant (χ2=9.43,P=0.002;χ2=7.53,P=0.006;χ2=8.12,P=0.004,χ2=6.04,P=0.016). The CD4+/CD8+value of post treatment in group A1 (1.87±0.78) reduced significantly compared with that of prior treatment (2.19±0.94), the difference was statistically significant (t=3.39,P=0.001); the CD4+/CD8+values of post treatment in groups B1 and B2 (1.12±0.53, 1.27±0.76 respectively) increased significantly compared with that of prior treatment (0.79±0.34, 0.87±0.49), the differences were statistically significant (t=4.88,P=0.001,t=3.98,P=0.001); Conclusion This study shows that CD4+/CD8+=1 can be used as an indication of immune therapy. When CD4+/CD8+<1, patients with pulmonary tuberculosis, extensive lesions of pulmonary tuberculosis and combined pulmonary tuberculosis, the immune therapy can accelerate the absorption of lesions.

Tuberculosis; Pulmonary; Immunotherapy; Active; Treatment outcome； Data interpretation, Statistical analysis; Comparative effectiveness research

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.006

上海市科委資助課題(14411966500)；江蘇省條件建設與民生科技專項資金(BL2014067)

200433 同濟大學附屬上海市肺科醫院 結核病臨床研究中心 上海市結核(肺)重點實驗室(何婭、范琳)；江蘇大學附屬鎮江市第三人民醫院(潘洪秋)

范琳，Email：fanlinsj@163.com

2016-10-23)