果樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究進(jìn)展

李海英++邵靜++張學(xué)明++鄭亞杰

摘 要：植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是一種新型的培養(yǎng)技術(shù)，在育種、生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物和生物工程中，具有廣泛的應(yīng)用。本文主要分析了植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)主要影響因素，并綜述了果樹方面的研究概況，討論了今后發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：果樹；懸浮細(xì)胞；培養(yǎng)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：Q31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170133039

1 果樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究概況

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)最初用于草本植物，直到20世紀(jì)90年代初，學(xué)界才在木本植物中應(yīng)用的研究報(bào)道。例如，利用懸浮培養(yǎng)中國(guó)小葉楊，成功獲得了懸浮細(xì)胞系并得到再生植株。

1.1 懸浮培養(yǎng)體系建立方面

自1954年Muir等第1次進(jìn)行植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以來，國(guó)內(nèi)外在此方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。Dheda等成功地由煮食蕉 Bluggoe（ Musa spp. ABB）建立起胚性細(xì)胞懸浮系，并通過體胚發(fā)生途徑獲得再生植株。張進(jìn)仁等以錦橙試管苗下胚軸切段誘導(dǎo)愈傷組織，首次用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法獲得柑桔植株。陳崇順對(duì)杏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，選用未木質(zhì)化的外植體，提高培養(yǎng)基中Ca（N03）2 、2，4-D和激動(dòng)素的濃度，增加繼代培養(yǎng)次數(shù)，能快速得到100% 的脆散型愈傷組織，成功地建立其細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)。周玉萍等以基因型不同的香蕉、大蕉和粉蕉吸芽莖尖培養(yǎng)產(chǎn)生的分生芽為外植體，不經(jīng)過愈傷組織階段直接由莖尖分生細(xì)胞，得到許多成分單一、分裂能力強(qiáng)大的胚性細(xì)胞懸浮系。BLANDO 等和INFANTE利用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，來培養(yǎng)森林草莓葉片愈傷組織，首次獲得了再生植株。

1.2 果樹育種方面

目前，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)育種方式，已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外得到推廣和應(yīng)用。鮑雷珍、李佩芬等以葡萄花絲為材料懸浮培養(yǎng)后，用秋水仙素進(jìn)行誘變處理獲得了變異體（同質(zhì)變異體）植株。徐春香等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將香蕉抗凍蛋白AFP基因，轉(zhuǎn)入胚型懸浮細(xì)胞系中，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.3 次生代謝物培養(yǎng)方面

懸浮體系在植物次生代謝物規(guī)模化培養(yǎng)中應(yīng)用非常多，但在果樹方面的應(yīng)用還較少。龍小鳳等以巨峰葡萄果皮作為外植體，通過研究，發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)下的愈傷組織更適合懸浮培養(yǎng)，利用這種培養(yǎng)方式，白藜蘆醇產(chǎn)量可達(dá)3.38 mg/L。曲均革等利用葡萄細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物花青素的研究取得了一些進(jìn)展，認(rèn)為接種量為1.60g 時(shí)，經(jīng)過7d 繼代周期培養(yǎng)條件下花青素合成相對(duì)穩(wěn)定。

2 果樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中的主要影響因素

2.1 愈傷組織的狀態(tài)

愈傷組織狀態(tài)如何，對(duì)細(xì)胞懸浮系的穩(wěn)定情況具有重要影響。愈傷組織可分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。研究表明，只有胚性愈傷組織能成功建立胚性細(xì)胞懸浮系。張進(jìn)仁等對(duì)幼嫩新鮮愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該愈傷組織生長(zhǎng)快、繁殖系數(shù)高，能夠較好地用于建立懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系。

2.2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)初始密度

細(xì)胞在進(jìn)行分裂和生長(zhǎng)的時(shí)候，需要其內(nèi)源代謝物質(zhì)達(dá)到一定的閥值，只有在細(xì)胞初始密度與營(yíng)養(yǎng)物比例合理，培養(yǎng)效果才能達(dá)到理想狀態(tài)。周春江等對(duì)草莓懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究表明，體積為40mL的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液，以4～6 mL接種量為宜。程江華在150mL三角瓶中加入25mL培養(yǎng)基，當(dāng)接種量為3g鮮重時(shí)，石榴細(xì)胞增殖速度快，增值倍數(shù)可達(dá)2.83倍，且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、分散性都比較好，但當(dāng)接種量小于2g/25mL時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度就會(huì)趨緩，而在大于4g/25mL時(shí)，不僅細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩，還會(huì)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

2.3 搖床轉(zhuǎn)速

由于植物細(xì)胞體積大，細(xì)胞壁主要由纖維素組成，液泡占到95 % 以上，對(duì)剪切力比較敏感，因而必須要控制好搖床的轉(zhuǎn)速，一般控制在90～120r/min內(nèi)為宜 。但涂藝聲等認(rèn)為草珊瑚的懸浮培養(yǎng)物最佳的搖床轉(zhuǎn)速為40r/min，在100r/min 速度下振蕩培養(yǎng)幾乎難以存活。

2.4 激素濃度

在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，激素是調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)的重要因素。倪建偉等以野生唐古特白刺為外植體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)激素2，4-D是影響愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量和形態(tài)的主要影響因子。王巍巍等在沙棗細(xì)胞懸浮培養(yǎng)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)激素組合對(duì)沙棗細(xì)胞生長(zhǎng)影響很大，尤其是附加 BA 0.1mg/L和 TDZ 0.1mg/L組合的NT液體培養(yǎng)基，細(xì)胞增長(zhǎng)系數(shù)達(dá)到5.73。陳崇順等通過對(duì)誘導(dǎo)杏的莖段愈傷組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2，4-D是組織形成、生長(zhǎng)必需的。不過，杏的品種不同，對(duì)2，4-D的濃度敏感性也存在差異。魏岳榮等以貢蕉 （AA）未成熟雄花序?yàn)橥庵搀w，建立胚性細(xì)胞懸浮系，結(jié)果表明，9μmol /L 2，4-D對(duì)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率為40.96% ，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)7.45 %。

2.5 蔗糖濃度

蔗糖是植物賴以生長(zhǎng)的重要碳源，也是滲透壓調(diào)節(jié)劑，對(duì)植物具有重要作用。張潔在草莓懸浮培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在 0～30g/L 時(shí)，細(xì)胞增殖倍數(shù)隨著蔗糖濃度增加而上升，30g/L時(shí)細(xì)胞的增殖倍數(shù)達(dá)到最大，而超過60g/L的時(shí)候，細(xì)胞增殖倍數(shù)就會(huì)顯著降低。杜曉映認(rèn)為，合適的蔗糖濃度為30g/L。

2.6 有機(jī)附加物

木本植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)以無機(jī)氮為主，有時(shí)輔以有機(jī)氮源，氨基酸是常用的有機(jī)氮源之一。在禾本科植物胚性細(xì)胞懸浮系的建立中，已對(duì)椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白等的作用進(jìn)行了研究，多數(shù)結(jié)果表明，有機(jī)添加物能促進(jìn)胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的增殖、生長(zhǎng)，提高其胚胎發(fā)生能力。在M1培養(yǎng)基中加入酪蛋白和脯氨酸，將有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.7 繼代周期

繼代周期的長(zhǎng)短和換液比例，會(huì)影響懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。如果繼代周期短，將會(huì)降低細(xì)胞生長(zhǎng)速度，反之，則會(huì)因細(xì)胞液泡變大，而導(dǎo)致懸浮細(xì)胞極度“饑餓”。陳崇順等根據(jù)杏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)結(jié)果，認(rèn)為增加繼代培養(yǎng)次數(shù)，將會(huì)有效提高愈傷組織的脆散性，達(dá)到5次時(shí)，具有高脆散性愈傷組織的比例可達(dá)90% 以上。

3 發(fā)展前景

根據(jù)植物細(xì)胞懸浮系自身的特點(diǎn)，可以用于生產(chǎn)次生代謝物，此類研究在中藥方面比較普遍，在果樹方面的報(bào)道還很少，具有很大開發(fā)潛力。此外，可以廣泛應(yīng)用到果樹育種中：直接用于原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與雜交。根據(jù)已有報(bào)道，將愈傷組織懸浮細(xì)胞系或胚性懸浮系作為分離原生質(zhì)體的起始材料，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力都比較高，培養(yǎng)也更容易。而原生質(zhì)體能克服性細(xì)胞不親和障礙，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣的體細(xì)胞雜交；用于基因轉(zhuǎn)移。通過引入外源基因，增強(qiáng)植物抗病毒、抗蟲、抗逆、抗除草劑、改良果實(shí)品質(zhì)等能力；篩選突變體。用誘變劑直接處理懸浮培養(yǎng)的單細(xì)胞和原生質(zhì)體，篩選所需要的突變體，是直接獲得同質(zhì)突變體的最理想方法。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)對(duì)果樹品種改良，具有關(guān)鍵作用，發(fā)展前景比較廣闊，如何在實(shí)踐中，成功應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)，是我國(guó)育種工作者在今后的育種研究中重點(diǎn)探索的內(nèi)容之一。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：鄭亞杰（1960-），女，遼寧省開原市，本科，研究員，果樹遺傳育種與栽培技術(shù)。