酶解法提取銀杏葉多糖的初步研究*

張 琳，張 彥，仙 靚，張 寒，丁淑梅，汪興軍，申旭霽，劉文斌

(1.西安市中心醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；3.西安交通大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 西安 710065)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(GinkgobilobaL.)的干燥葉，主要活性成分較為復(fù)雜，主要含有黃酮類、銀杏內(nèi)酯，此外還有銀杏葉多糖、銀杏酸、聚戊烯醇及微量元素等。其中，銀杏葉多糖是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有降血糖[1]、抗腫瘤[2]等多種作用。雖有銀杏多糖的提取研究報道，但通過酶解法來提取銀杏多糖的研究較少見。作者比較傳統(tǒng)水提法與酶解法提取銀杏多糖的提取效率，考察酶解法提取銀杏多糖的可行性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

銀杏葉：采自西安醫(yī)學(xué)院未央校園，由生藥教研室汪興軍老師鑒定為GinkgobilobaL.；D-無水葡萄糖：上海雅吉生物科技有限公司；濃硫酸：分析純，西隴化工有限公司；蒽酮：分析純，上海科豐化學(xué)試劑有限公司；乙醚：分析純，利安隆博平醫(yī)藥化學(xué)有限公司；氯仿：分析純，成都市科化化工試劑廠；正丁醇：分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；纖維素酶：成都艾科達化學(xué)試劑有限公司。

高速萬能粉碎機：FW100D-FW-1000AD，天津鑫博得儀器有限公司；電子天平：BSA224S，賽多斯科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-S-6，北京市永光明儀器廠；循環(huán)水真空泵：SHZ-D，鞏義市予華儀器有限公司；干燥箱：101-1，上海市實驗儀器總廠；紫外可見分光光度儀：UV-160A，日本島津有限公司；變換紅外光譜儀：TENSOR27，德國布魯克。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品約0.025 0 g，精密稱定，溶解并定容于250 mL容量瓶中。

蒽酮-濃硫酸：取蒽酮約0.2 g，精密稱定，溶解于5 mL乙醇中，再于100 mL容量瓶中以質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%硫酸定容至刻度，搖勻。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的配制(pH=4.5)：取醋酸鈉約1.8 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，量取0.98 mL冰醋酸，用蒸餾水定容至刻度。

Sevag試劑的配制：量取氯仿40 mL，正丁醇8 mL，混勻。

碘-碘化鉀的配制：取碘化鉀約0.8 g，精密稱定，置于燒杯中,加入2 mL水溶解，再精確稱取碘0.1 g加入，待全部溶解，移至10 mL容量瓶中，定容至刻度。

淀粉指示液的配制：取淀粉約0.5 g，精密稱定，用20 mL水溶解，量取80 mL水在電熱套上加熱至沸騰，加入淀粉液，至沸取出，冷卻。

1.2.2 銀杏葉中多糖的提取

1.2.2.1 不同提取方法提取多糖

將200 g銀杏葉洗凈、曬干、粉粹、50 ℃干燥備用。

酶法：稱取銀杏葉粉10 g，放置于250 mL燒瓶中，加蒸餾水150 mL，50 ℃恒溫振蕩2 h，加入纖維素酶0.05 g，用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH≈4.5，50 ℃水浴酶解50 min,抽濾，藥渣加入50 mL蒸餾水，水浴提取2.5 h,抽濾，合并提取液[3-4]。

水提法：稱取銀杏葉粉10 g，放置于250 mL燒瓶中，加蒸餾水150 mL，50 ℃恒溫振蕩2 h，繼續(xù)在50 ℃水浴提取50 min，抽濾，藥渣加入50 mL蒸餾水，水浴提取2.5 h，抽濾，合并提取液。

1.2.2.2 除脂溶性雜質(zhì)[5]

銀杏葉提取液中加入10 mL乙醚，振蕩10 min，置于分液漏斗中靜置分液，收集下層的多糖溶液。

1.2.2.3 除蛋白質(zhì)[6]

使用Sevag法，將脫脂后的銀杏葉提取液與Sevag試劑以體積比3∶1 混合，充分振蕩20 min，置于分液漏斗中靜置分液，取上層溶液，得銀杏葉多糖提取液。

1.2.2.4 乙醇沉淀多糖[7]

在裝有多糖溶液的燒杯中加入3倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇，靜置12 h；將沉淀后的多糖進行干燥，獲得銀杏葉多糖粗品。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖粗品提取量比較

平行操作三次，比較提取量，結(jié)果見表1。

表1 不同方法提取銀杏葉多糖提取量比較 g

由表1可知，酶解法的平均提取量高于傳統(tǒng)的水解法。

2.2 銀杏葉w(多糖粗品)的測定

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

移取0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，分別加蒸餾水至2 mL，再加入蒽酮-濃硫酸試劑8 mL充分混勻，于100 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，室溫冷卻，在620 nm波長下測吸光度，以吸光度A對葡萄糖質(zhì)量濃度ρ繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見圖1。

ρ/(mg·mL-1)圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2w(多糖)測定[8]

取銀杏葉多糖粗品約15 mg，精密稱定，于50 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度。將溶液過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液1.5 mL，加入水0.5 mL，再加入蒽酮-濃硫酸試劑8 mL充分混勻，于100 ℃ 恒溫水浴鍋中保溫10 min，室溫冷卻，用紫外可見分光光度計在620 nm波長下測吸光度，平行三次，計算平均w(多糖)，結(jié)果見表2。

表2 銀杏葉w(多糖)

由表2可知，銀杏葉粗提物中平均w(多糖)為3.33%。

2.3 酶解法提取的銀杏葉多糖產(chǎn)品分析

2.3.1 理化性質(zhì)

干燥后的銀杏葉多糖為灰白色粉末，水溶性較好，難溶于乙醇等有機試劑。

2.3.2 淀粉的碘反應(yīng)[9]

將多糖配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的溶液，取多糖指示液上清液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的多糖溶液各5 mL，加入碘-碘化鉀0.2 mL，水浴加熱5 min，觀察顏色變化。銀杏葉多糖溶液的碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性，表明銀杏葉多糖不含淀粉。

2.3.3 銀杏葉多糖紅外光譜分析

將多糖與溴化鉀烘干，取多糖2 mg與100 mg的溴化鉀研磨，壓片，在400～4 000 cm-1用紅外光譜儀器進行掃描，紅外色譜圖見圖2。

σ/ cm-1圖2 銀杏葉多糖紅外吸收光譜

3 結(jié) 論

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