易脆毛霉多糖對煙草幼苗的促生效果及煙草花葉病毒的抑制作用

張莉++李現(xiàn)道++張國超++杜傳印++孟慶洪++劉春菊++于金鳳+劉愛新

摘要：為了解易脆毛霉多糖的抗病促生效果，本研究采用盆栽試驗和半葉枯斑法測定了該多糖處理對煙苗生長的影響及TMV的抗性。結果表明，多糖處理對煙苗有明顯的促生作用，多糖處理煙苗最大葉面積、地上部鮮重、根部鮮重、總葉綠素含量和光合速率均顯著增加；多糖處理對TMV的預防效果最好，可達62%，鈍化效果次之，治療效果相對較差，均低于40%。表明，易脆毛霉多糖不僅可以促進煙苗生長，而且對TMV有較好的預防作用，可為今后開發(fā)利用該真菌多糖提供參考。

關鍵詞：易脆毛霉多糖；促生作用；煙草花葉病毒；抑制作用

中圖分類號：S572.01文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）02-0127-05

真菌多糖是一類天然高分子化合物，廣泛存在于真菌特別是大型真菌的細胞壁中，因其具有抗腫瘤、抗病毒[1]和免疫調節(jié)[2]等作用而被醫(yī)藥界廣泛關注。真菌多糖為β型多糖，常見的有幾丁聚糖、氨基寡糖素、菇類蛋白多糖等，許多研究表明，這類多糖不僅具有抑殺真菌、細菌和病毒的作用，而且能夠調節(jié)作物生長，誘導植物產生抗性[3]。作為天然化合物，真菌多糖還具有無毒、易被降解、對環(huán)境無污染等特性，使其有可能作為一種新型植物抗病誘導劑在農業(yè)生產中發(fā)揮重要作用[4]。

病毒病是煙葉生產中最重要的病害之一，常見煙草病毒病包括馬鈴薯Y病毒、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）等。國內外對煙草病毒病防治做了大量研究，并取得了一些進展[5-7]，但生產上仍缺乏對煙草病毒病的有效控制措施。真菌多糖作為一種新型抗病毒物質越來越受重視，吳艷兵等[8]和羅琰[9]分別研究了毛頭鬼傘多糖和香菇多糖的抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)兩種多糖對TMV均有較強的抑制作用。本研究從一株易脆毛霉中提取多糖粗提物，分析該多糖處理對煙苗生長的影響及TMV的室內抑制作用，為易脆毛霉多糖的進一步應用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

菌株材料：易脆毛霉（Mucor fuagilis）菌株DBJ-1，由山東農業(yè)大學分子植物病理學實驗室保存；TMV病毒，由山東農業(yè)大學劉紅梅老師提供。

供試煙草品種：煙草品種K326，用于促生作用分析；三生煙（Nicotiana tabacum var. Samsun NN），用于TMV抗性分析。

培養(yǎng)基：易脆毛霉培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基；DBJ-1發(fā)酵培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基，具體配比參照牛小義[4]的方法，組成成分包括冷榨豆餅粉1%，蛋白胨0.2%，葡萄糖3%，MgSO4 0.05%，KH2PO4 0.10%，維生素B1 0.01%，調節(jié)pH至5.5。

1.2方法

1.2.1多糖提取將DBJ-1接種于PDA培養(yǎng)基，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)6～7 d，挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min培養(yǎng)7 d，5 000 r/min離心10 min收集菌絲體，無菌水充分洗滌。菌絲體于65℃烘箱烘至恒重，干菌絲在研缽中研細，過80目篩制成干粉。菌絲體干粉加40倍水，80℃水浴浸提2 h，重復兩次，合并兩次提取液，濃縮至原體積的1/15，緩慢加入3倍體積的95%乙醇，4℃靜置過夜，8 000 r/min離心10 min，留取沉淀，沉淀相繼以95%乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得到多糖。

1.2.2多糖含量測定 ① 葡萄糖標準曲線的建立。參照陶美華等[10]的方法 ，準確稱取葡萄糖100 mg，用無菌水制成1 mg/mL標準液，備用。分別吸取葡萄糖標準液采用倍比稀釋法配置成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL的葡萄糖溶液。取上述溶液各0.4 mL，加入5%重蒸苯酚0.8 mL，混勻，迅速加入濃硫酸 4 mL，沸水浴加熱15 min后，冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度。以水代替葡萄糖液為空白對照。根據(jù)糖濃度及吸光度值繪制回歸方程。

②多糖含量的測定。精密稱取多糖粉末50 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按照上述方法，測定吸光度，平行測定3次，得到3個樣品的多糖含量，計算平均值。

1.2.3多糖對煙苗的促生作用分析分別配制濃度為0.65 mg/mL和1.30 mg/mL的多糖溶液，選擇長勢一致的4～5葉期的煙草K326幼苗，將上述多糖溶液均勻噴施于煙葉表面，連續(xù)處理3次，每次間隔7 d，于最后一次處理7 d后，檢測葉片葉綠素含量、最大葉面積、鮮重等，每處理10 株煙苗。以清水同樣處理為對照。

1.2.4多糖對煙苗光合作用的影響采用1.2.3的方法處理煙苗，于最后一次處理后7 d測定煙苗的光合速率、蒸騰速率、氣孔導度及胞間CO2濃度，每處理10 株煙苗。以清水同樣處理為對照。

1.2.5多糖對TMV的抑制作用三生煙煙苗溫室內培養(yǎng)至5～6葉期，采用半葉法從3個方面分析多糖對煙草花葉病毒病的抗病效果。

①多糖對TMV的預防作用。選取長勢一致的煙苗，按1.2.3中的濃度配置多糖溶液，分別噴施到待測葉片右半葉，左半葉噴清水為對照，間隔7 d再噴一次，于第二次噴霧后2 d，采用摩擦接種法將20 μL TMV病毒汁液均勻涂抹到整個葉片，每株處理 3 片葉，每處理重復 3 次。

②多糖對TMV的治療作用。采用上述類似方法進行處理，所不同的是，在煙苗葉片接種TMV病毒汁液后1 d，噴多糖溶液于右半葉，以左半葉噴清水為對照。每株處理 3 片葉，每處理重復 3 次。

③多糖對TMV的鈍化作用。首先取上述配制好的多糖溶液與TMV病毒汁液按1∶1 的比例混勻，室溫下靜置30 min，將鈍化處理的病毒汁液摩擦接種到三生煙右半葉，左半葉接種用清水處理的病毒汁液為對照。每株處理 3 片葉，每處理重復 3 次。

經上述處理過的煙苗，于25℃、光12 h/暗12 h培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，統(tǒng)計各處理的枯斑數(shù)，計算抑制效果。計算公式如下：

枯斑抑制率（%）=（對照枯斑數(shù)-處理枯斑數(shù)）/對照枯斑數(shù)×100。

2結果與分析

2.1DBJ-1多糖含量測定

以糖濃度為橫坐標（X）、吸光度為縱坐標（Y），做出葡萄糖標準曲線（圖1），可見該曲線基本為一條直線，經計算得回歸方程為Y=3.7821X+0.0116， 其中R2=0.9904。由此可知，葡萄糖在0.02～0.14 mg/mL范圍內，標準曲線線性良好，利用該方程計算出DBJ-1多糖粗品中的多糖含量為65%。

圖1葡萄糖濃度標準曲線

2.2多糖處理對煙苗生長的促生作用

圖2為經多糖處理7 d后煙苗的生長狀況，可見，經兩種濃度的多糖處理，煙苗葉色濃綠，根系較發(fā)達。

a：0.65 mg/mL多糖處理；b： 1.30 mg/mL多糖處理；c： 對照。

圖2多糖處理對煙草幼苗生長的影響

對煙草葉片最大葉面積、鮮重、總葉綠素含量等進行測定，結果見表1，發(fā)現(xiàn)，與對照相比，經濃度0.65 mg/mL 和1.30 mg/mL多糖處理后，煙苗最大葉面積分別增加34.8%和59.0%，地上部鮮重分別增加58.9%和51.8%，根部鮮重分別增加200.0%和166.7%，總葉綠素含量分別增加27.6%和22.0%。差異顯著性分析表明，兩種濃度處理在最大葉面積、地上部鮮重、根部鮮重和總葉綠素含量等方面均顯著高于對照，但兩個處理濃度間均差異不顯著。

采用半葉枯斑法，從鈍化、治療和預防3個方面分析了多糖處理煙苗對TMV的抗性，結果如表3、圖3。可見，經多糖處理后，煙苗對TMV預防效果最好，0.65 mg/mL和 1.30 mg/mL濃度處理枯斑數(shù)分別比對照減少13.3個和11.7個，枯斑抑制率分別為52%和62%；多糖對TMV的鈍化效果次之，0.65 mg/mL和 1.30 mg/mL濃度處理的枯斑抑制率分別為40%和57%；多糖對TMV的治療效果相對較差，0.65 mg/mL和 1.30 mg/mL濃度處理治療效果均低于40%。差異顯著性分析表明，兩種多糖濃度處理后，對TMV 的抑制效果差異不顯著。

3討論與結論

由于真菌多糖的提取比較復雜，其在植物抗病防衛(wèi)中的應用目前還相對較少。近年來，利用真菌多糖粗提物防治植物病害的報道越來越多。牛小義等[11]研究發(fā)現(xiàn)，云芝多糖不僅能增加煙草對CMV的抗性，而且對煙草生長也有明顯的促進作用。其它報道的對植物病毒有抗病作用的多糖還有猴頭菇多糖、灰樹花多糖、毛頭鬼傘和香菇多糖等[4]，這些不同來源的多糖粗提物都顯示對病毒病有較好的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，易脆毛霉多糖粗提物處理煙草后，不僅植株的最大葉面積和鮮重顯著增加，而且葉片的葉綠素含量和光合效率都顯著增強；枯斑反應測定發(fā)現(xiàn)，該多糖對TMV也有很好的抑制作用，預防效果最好，最高可達62%，鈍化效果次之，均明顯高于治療效果。表明，易脆毛霉多糖不僅能促進煙草生長，而且能增強煙苗對TMV的抗性。鑒于該多糖良好的抗病促生效果，以及該物質對人畜和環(huán)境安全等特征，真菌多糖的應用符合當前生物防治發(fā)展的需要，具有良好的開發(fā)應用潛力，下一步將進行深入研究。

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收稿日期：2016-07-27