濟(jì)寧青山羊微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性分析

王可++劉昭華++崔緒奎++楚惠民+張玉玉+韓紅

摘要：選擇位于不同染色體上、具有較高多態(tài)性的12個微衛(wèi)星標(biāo)記，對濟(jì)寧青山羊群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，CSRD247等12個微衛(wèi)星標(biāo)記共檢測到97個等位基因，每個標(biāo)記都檢測到5個以上的等位基因，平均為8.08個，有效等位基因數(shù)為3.1957～6.2113個，基因頻率最高的是CSRD247 標(biāo)記的235 bp 片段（0.4583）；12個微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)信息含量（PIC）都在 0.630以上，均為高度多態(tài)標(biāo)記，遺傳多樣性豐富，其中 SRCRSP5 標(biāo)記的多態(tài)信息含量（PIC）最高，為 0.828，各標(biāo)記的觀測雜合度在0.4286～0.9048之間，期望雜合度在0.5981～0.8397之間，平均期望雜合度為0.7574，屬于高度雜合標(biāo)記和高度雜合品種，遺傳變異大。本研究可為濟(jì)寧青山羊品種的選種、選育及保種工作奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：濟(jì)寧青山羊；微衛(wèi)星標(biāo)記；多態(tài)性；遺傳多樣性

中圖分類號：S827.2文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）02-0142-05

濟(jì)寧青山羊（Jining grey goat）是我國著名的地方山羊品種，2006年被列為國家級畜禽遺傳資源保護(hù)品種[1]，主要分布在山東省西南地區(qū)的濟(jì)寧、菏澤等地，具有高繁多胎、肉質(zhì)鮮美、青猾皮輕柔薄暖等優(yōu)良的種質(zhì)特性[2]。近年來，濟(jì)寧青山羊由于受體型瘦小、生長速度緩慢等缺點(diǎn)的限制，與其他品種廣泛雜交，純種處于瀕危狀態(tài)[3]。

微衛(wèi)星DNA又稱簡單序列重復(fù)，廣泛存在于原核和真核生物的基因組中。微衛(wèi)星DNA 兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，尤其在親緣關(guān)系相近的物種間是保守的，在一些緊密相關(guān)的物種中，微衛(wèi)星DNA的重復(fù)單位和重復(fù)次數(shù)具有一定的相似性[4]，因此，可以利用微衛(wèi)星DNA作為PCR擴(kuò)增的靶基因，來鑒定物種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。同時，在同一物種的不同基因型個體間，微衛(wèi)星DNA的重復(fù)單位數(shù)目變異大，因而其長度具有高度的多態(tài)性，包含大量豐富的信息，可以作為遺傳多樣性分析的有效手段。微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記呈共顯性孟德爾式遺傳，能夠鑒別雜合體，對隱性性狀的選擇十分有利，不受環(huán)境條件和其它因素的影響，表現(xiàn)為中性標(biāo)記。與其它分子標(biāo)記（如等位酶、RFLP、RAPD 等）相比，微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記可檢測出更多的等位基因，能夠提供更細(xì)致的基因變化分析范圍，具有極顯著的優(yōu)越性[5]。近年來，微衛(wèi)星DNA在山羊群體多樣性分析、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、保種效果評價等方面得到了廣泛應(yīng)用[6-9]，為山羊遺傳育種提供了重要依據(jù)。為了解濟(jì)寧青山羊群體的遺傳多樣性，本研究選擇12個微衛(wèi)星標(biāo)記對濟(jì)寧青山羊群體進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)記的多態(tài)性、基因雜合度等，以期了解濟(jì)寧青山羊群體的雜合程度，為品種提純復(fù)壯、繁殖更新、擴(kuò)大群體規(guī)模奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)樣本采自黃河青山羊保種場（山東省梁山縣），隨機(jī)取12月齡左右濟(jì)寧青山羊耳組織，每只取5 g，置于裝有70%乙醇的滅菌離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩９?4個樣本，試驗(yàn)羊個體間無血緣關(guān)系。

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、PCR Mix等均購自天根生化科技（北京）有限公司。

儀器有Eppendorf PCR擴(kuò)增儀、BIO-RAD凝膠成像儀及電泳系統(tǒng)、ABI 3100-Avant全自動基因序列分析儀、Eppendorf高速臺式離心機(jī)、NanoDrop 2000分光光度計(jì)、電熱恒溫水槽。

1.2基因組DNA提取

采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取羊基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物合成與PCR反應(yīng)體系

參照聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）及國際遺傳學(xué)會（ISAG）的推薦，共篩選出12對熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物（表1），由魯生生物技術(shù)有限公司合成。5′FAM為藍(lán)色熒光標(biāo)記，5′HEX為綠色熒光標(biāo)記，5′TAMRA為紅色熒光標(biāo)記。以羊樣本基因組DNA為模板，利用各種微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：PCR Mix 6.25 μL，10 mmol/L上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，補(bǔ)水至12.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，相應(yīng)溫度退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測并拍照。

1.4微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

本研究的微衛(wèi)星多態(tài)性分析采用ABI3100-Avant全自動基因序列分析儀進(jìn)行。

具體操作步驟：（1）分別取PCR產(chǎn)物、去離子甲酰胺、內(nèi)標(biāo)0.5、10、0.5 μL混合，95℃變性5 min，之后用ABI 3100進(jìn)行分析。（2）其結(jié)果用3100 Data Collection軟件分析微衛(wèi)星基因型。其中內(nèi)標(biāo)為粉紅色。

1.5數(shù)據(jù)分析

所獲數(shù)據(jù)經(jīng)前期處理，用POPGEN 1.32計(jì)算等位基因數(shù)（No）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因頻率、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）。多態(tài)信息含量（PIC）用PIC分析軟件計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

對12個微衛(wèi)星基因座進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將其擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，12個微衛(wèi)星標(biāo)記的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶均為一條或兩條，符合微衛(wèi)星標(biāo)記的基本特征，可用于后續(xù)的遺傳信息分析。CSRD247檢測結(jié)果見圖1。

利用ABI 3100-Avant全自動基因序列分析儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行12個微衛(wèi)星位點(diǎn)共64個樣本的分型測定，部分結(jié)果見圖2。由圖2可知，12個微衛(wèi)星位點(diǎn)的電泳圖具有典型性峰形，易于判型，保證了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

2.2微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分析

微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因類型和等位基因頻率能夠反映群體內(nèi)的變異程度。經(jīng)統(tǒng)計(jì)得知，CSRD247 等12個微衛(wèi)星標(biāo)記共檢測到97個等位基因（表2），每個標(biāo)記都檢測到5個以上的等位基因，說明所選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳信息比較豐富。在所有微衛(wèi)星標(biāo)記中，以TCRVB6 標(biāo)記檢測到的等位基因數(shù)目最多，為11個，其片段大小為 229～252 bp；INRA063檢測到的等位基因數(shù)目最少，只有5個，片段大小為170～178 bp。

在所有檢測到的等位基因中，以CSRD247標(biāo)記235 bp片段的基因頻率最高，為 0.4583，其次是INRA063標(biāo)記172 bp片段的基因頻率（0.4362）；而SRCRSP8標(biāo)記的 248 bp片段、TGLA53標(biāo)記的 151 bp片段的基因頻率最低，均為0.0104。

2.3多態(tài)信息含量與群體雜合度

多態(tài)信息含量（PIC）用來描述微衛(wèi)星標(biāo)記的變異程度，可用于估計(jì)群體內(nèi)的遺傳變異程度，當(dāng) PIC>0.50時為高度多態(tài)標(biāo)記，0.25

由表3可知，本研究中的12個微衛(wèi)星標(biāo)記均為高度多態(tài)標(biāo)記， 多態(tài)信息含量在0.631～0.828之間，說明基因變異較大，濟(jì)寧青山羊群體遺傳多樣性豐富，各位點(diǎn)相關(guān)性狀均未受到強(qiáng)大選擇壓力的影響，選擇潛力較大。

有效等位基因數(shù)（Ne）反映了群體遺傳變異大小。如果有效等位基因數(shù)接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因分布均勻。根據(jù)表2、表3中的數(shù)據(jù)，等位基因觀察數(shù)和有效等位基因數(shù)都相差較大，說明在這些基因座上，群體的等位基因分布不均勻，遺傳差異較大，這可能是由地理隔離以及人工選擇所造成。

3討論與結(jié)論

微衛(wèi)星DNA主要分布于非編碼區(qū)，與分布于編碼區(qū)的序列相比，由于選擇壓力較小而變異程度更大。微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性能夠反映物種的進(jìn)化歷史，群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的，其余的等位基因是在進(jìn)化過程中由該基因突變形成的[10]。如濟(jì)寧青山羊SRCRSP8基因座的230 bp和232 bp片段就有可能是原始基因，而236 bp和240 bp片段含量極少，極有可能是突變基因。

遺傳多樣性分析能夠反映群體內(nèi)的遺傳變異情況，可以作為群體間遺傳關(guān)系的劃分依據(jù)。本研究選用了分布在不同染色體（12個微衛(wèi)星標(biāo)記分別分布在 6 條染色體上）上、多態(tài)性較高的標(biāo)記，以盡可能提供較多的遺傳信息，且擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小多在115～280 bp之間，便于獲得擴(kuò)增產(chǎn)物和結(jié)果統(tǒng)計(jì)。12 個微衛(wèi)星標(biāo)記均檢測到5個以上的等位基因，多態(tài)信息含量非常豐富，客觀地反映了濟(jì)寧青山羊的遺傳信息。本研究通過對64只濟(jì)寧青山羊個體12個微衛(wèi)星座位基因數(shù)據(jù)的多態(tài)信息含量（PIC）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）的分析一致說明：該品種的遺傳多樣性信息豐富，提供的遺傳信息量大，反映出在品種的選育過程中，所用的親本材料來源廣泛，可能與導(dǎo)入了外血、選育時間短等有關(guān)。這一結(jié)果與近年來由于外來品種（波爾山羊、奶山羊、黑山羊等）引入導(dǎo)致濟(jì)寧青山羊群體部分遺傳資源散失、保種工作滯后致使品種處于瀕危狀態(tài)的現(xiàn)狀相吻合。

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山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2017，49（2）：147～150Shandong Agricultural Sciences山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)第49卷第2期朱榮生，等：冷藏期間豬肌肉中肌苷酸沉積規(guī)律研究DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.02.031

收稿日期：2016-08-12

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31501928）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2014QNM41）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2015GNC111011）；山東省自然基金項(xiàng)目（ZR2015CM007）

作者簡介：朱榮生（1976-），男，山東陽谷人，副研究員，碩士，主要研究方向：動物營養(yǎng)。E-mail：zrschevy@163.com

通訊作者：呼紅梅（1976-），女，山東冠縣人，副研究員，碩士，主要研究方向：動物營養(yǎng)。E-mail：huhongmeipatty@163.com