小麥品種抗病相關(guān)分子標(biāo)記檢測(cè)研究

彭振英++崔海燕++李娜娜++張斌++丁漢鳳

摘要：利用分子標(biāo)記選育抗病小麥新品種已經(jīng)成為一種快速有效的育種方法。本研究用29對(duì)抗病分子標(biāo)記對(duì)354個(gè)小麥品種進(jìn)行檢測(cè)，分析這些標(biāo)記在小麥品種中的分布情況。結(jié)果顯示，檢測(cè)到多個(gè)小麥品種同時(shí)含有多個(gè)標(biāo)記，如黑麥AR132同時(shí)含有抗白粉病、葉銹病、紋枯病標(biāo)記；淮麥0607、SN086218、石新733、徐30、濰74987、周麥28、中麥1219、連05167、淮05155、Jagger、CP02-62-1-2-2-2-1、中育01089同時(shí)含有抗白粉病、葉銹病、赤霉病標(biāo)記。本研究為小麥聚合育種提供了一定依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥；抗病性；分子標(biāo)記檢測(cè)；分子標(biāo)記輔助育種；聚合育種

中圖分類號(hào)：S512.103.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）02-0001-09

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)70年代，是一種理想的、基于DNA 變異的新型遺傳標(biāo)記，它能反映生物個(gè)體或種群基因組中的差異特征[1]。分子標(biāo)記突破了表達(dá)基因的范圍而不受基因表達(dá)的影響，可在任何組織、任何發(fā)育階段進(jìn)行檢測(cè)。DNA 分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用為建立分子標(biāo)記輔助選擇的農(nóng)作物育種體系打開一扇新大門。目前，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)（marker-assisted selection，MAS）在作物遺傳育種上的應(yīng)用越來越廣泛，分子標(biāo)記聚合育種得到很大發(fā)展，尤其是分子標(biāo)記技術(shù)與常規(guī)育種的緊密結(jié)合，為作物育種技術(shù)帶來一場(chǎng)新的變革。

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，利用MAS選育高抗小麥品種也已如火如荼地開展起來。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了58個(gè)小麥抗白粉病基因[2，3]、90個(gè)抗葉銹病基因[4]、100多個(gè)抗條銹病基因[5]、52個(gè)赤霉病抗性相關(guān)QTL[6]、15個(gè)抗紋枯病分子標(biāo)記[7]、1個(gè)抗黃矮病基因Bdv2[8]。董建力等[9]通過聚合雜交將3個(gè)小麥抗白粉病標(biāo)記Pm4b、Pm13和Pm21聚合在一起，從F3代群體中篩選出同時(shí)含有2～3個(gè)標(biāo)記的株系。王心宇等[10]采用早代進(jìn)行抗性鑒定結(jié)合MAS策略，篩選到14株P(guān)m4a+Pm21的植株，16株P(guān)m2+Pm4a的植株，6株P(guān)m8+Pm21的植株，其后代的抗病性明顯提高。曾祥艷等[11]利用MAS選育出兼抗黃矮病、白粉病和條銹病的小麥新種質(zhì)。這些研究為培育持久、廣譜抗病小麥品種奠定了基礎(chǔ)。

然而迄今為止，研究者們對(duì)中國(guó)小麥品種遺傳背景的了解仍不全面，每個(gè)小麥品種中含有多少個(gè)抗性分子標(biāo)記，至今未做大規(guī)模系統(tǒng)調(diào)查。本研究檢測(cè)了354份常規(guī)小麥品種的抗病相關(guān)分子標(biāo)記，旨在為抗性小麥品種選育提供一定參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)室共計(jì)保存近600份小麥品種資源，選取其中的354份常規(guī)小麥品種進(jìn)行抗病相關(guān)分子標(biāo)記檢測(cè)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1取材每個(gè)小麥品種隨機(jī)取10粒種子進(jìn)行萌發(fā)，萌發(fā)10天時(shí)，每株取頂葉混合研磨用于提取基因組DNA。

1.2.2基因組DNA提取采用CTAB法提取各材料基因組DNA[12]。用核酸儀測(cè)定DNA濃度，并稀釋到50～60 ng/μL用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3引物合成根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的小麥抗病基因引物序列（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.4PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：總體積20.0 μL，其中含有2×PCR Mix（百泰克）10.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1.0 min，退火0.5 min（退火溫度根據(jù)各引物退火溫度而定），72℃延伸0.5～1.0 min（根據(jù)各引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定），共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用相應(yīng)濃度聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，紫外凝膠成像儀觀察、拍照。

2結(jié)果與分析

2.1抗白粉病分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

利用13對(duì)抗白粉病分子標(biāo)記對(duì)354個(gè)小麥品種進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。其中引物Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR（圖1A）、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、LAG95+1F/LAG95+2R、Xgwm337F/Xgwm337R檢測(cè)的小麥品種較多，其檢出數(shù)量分別占所檢品種總數(shù)的51.1%、50.3%、40.7%、40.7%。并且這些標(biāo)記之間具有一定的關(guān)聯(lián)，83個(gè)小麥品種均同時(shí)含有這四個(gè)標(biāo)記；142個(gè)品種同時(shí)含有標(biāo)記Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、Xgwm337F/Xgwm337R；99個(gè)品種同時(shí)含有標(biāo)記Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、LAG95+1F/LAG95+2R；177個(gè)品種同時(shí)含有標(biāo)記Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR和Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR。

Pm4bF/Pm4bR能夠在38個(gè)小麥品種中擴(kuò)增出目的條帶（475 bp）（圖1B），占所有檢查品種的10.7%。C1F/R1R能夠在44個(gè)小麥品種中檢測(cè)出目的條帶（470 bp）（圖1C），占所有檢查品種的 12.4%。BCD135-1F/BCD135-1R、BCD135-2F/BCD135-2R二對(duì)引物未在任何品種中檢測(cè)出目的條帶。

3討論與結(jié)論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用MAS將是未來抗性小麥品種培育的方向。因此全面了解各個(gè)小麥品種至少是小麥核心種質(zhì)分子水平的遺傳背景是必不可少的，因?yàn)橹挥羞@樣才能做到有的放矢地配制多種雜交組合，將多個(gè)抗性基因聚合到一起，培育多抗小麥品種。但是目前國(guó)內(nèi)有關(guān)這方面的研究報(bào)道還不多。本研究用13對(duì)抗白粉病分子標(biāo)記、7對(duì)抗葉銹病分子標(biāo)記、2對(duì)抗條銹病分子標(biāo)記、4對(duì)抗赤霉病分子標(biāo)記、2對(duì)抗紋枯病分子標(biāo)記、1對(duì)抗黃矮病分子標(biāo)記對(duì)354個(gè)小麥品種的抗性背景在分子層面進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到多個(gè)小麥品種同時(shí)含有多個(gè)標(biāo)記，如黑麥AR132同時(shí)含有抗白粉病、葉銹病、紋枯病基因；淮麥0607、SN086218、石新733、徐30、濰74987、周麥28、中麥1219、連05167、淮05155、Jagger、CP02-62-1-2-2-2-1、中育01089同時(shí)含有抗白粉病、葉銹病、赤霉病基因。

孫果忠[43]用Pm4a/bF/Pm4a/bR檢測(cè)了75個(gè)小麥品種，其中4個(gè)品種含有此標(biāo)記，占5%。本試驗(yàn)檢出4%的小麥品種含有此標(biāo)記，二者基本相符。胡娜[44]用Pm2、Pm4、Pm13、Pm21、Pm30、Pm34分子標(biāo)記對(duì)260份小麥育種親本材料進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，其中149份材料含有Pm2單基因（占57.31%），這與本研究結(jié)論相符（51.1%），可見Pm2標(biāo)記在小麥中廣泛存在。魏新燕等[36]對(duì)150個(gè)小麥品種的抗葉銹基因Lr35進(jìn)行分子檢測(cè)，檢測(cè)出 8 個(gè)小麥品種（6068、白蚰包、中麥9、早洋、碧瑪1號(hào)、小偃7631、東方紅3號(hào)和 Madsen）含有Lr35標(biāo)記，檢出率較低，本研究在354個(gè)小麥品種中僅檢出周麥20含有該標(biāo)記，檢出率也相當(dāng)?shù)汀?/p>

利用分子標(biāo)記選育小麥新品種具有諸多優(yōu)勢(shì)，但是隨著時(shí)間的推移，一些生理小種出現(xiàn)了變異導(dǎo)致部分標(biāo)記失效。孫果忠[43]對(duì)101個(gè)分子標(biāo)記的實(shí)用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)可用于MAS的標(biāo)記有51個(gè)，占供試標(biāo)記的50.5%，此類標(biāo)記可直接用于MAS育種；28個(gè)標(biāo)記喪失了有效性，不能再用于MAS育種。雷秀玉[45]對(duì)145個(gè)主推小麥品種進(jìn)行了苗期白粉病抗性鑒定以及小麥抗白粉病基因分子標(biāo)記的實(shí)用性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，Pm8基因在145個(gè)供試品種（系）中的分布頻率為52.4%，但對(duì)白粉病菌群體已喪失抗性；Pm2、Pm4、Pm6、Pm12、Pm13、Pm16、Pm17、Pm21和Pm24基因?qū)Π追鄄【后w抗性好，但在145個(gè)供試品種中的分布頻率較低，介于0～9.7%。研究表明，將多個(gè)抗病基因聚合在一起可以顯著提高品種抗病性。董建力等[9]通過復(fù)合雜交將抗小麥白粉病基因Pm4b、Pm13、Pm21聚合到推廣品種。王心宇發(fā)現(xiàn)聚合Pm2+Pm4a、Pm4a+Pm21、Pm8+Pm21的后代植株抗性增強(qiáng)[10]。全面系統(tǒng)地調(diào)查不同小麥品種中含有的抗病分子標(biāo)記，對(duì)于小麥聚合育種具有重大意義。

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