Ang- 2 及Tie- 2 在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

戴珍珍 陳凱英 朱紅賢 鐘國平 顧昕

Ang- 2 及Tie- 2 在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

戴珍珍 陳凱英 朱紅賢 鐘國平 顧昕

目的探討血管生成素-2（Ang-2）及其受體內皮細胞特異性酪氨酸激酶受體（Tie-2）在宮頸癌組織中發生、發展和臨床病理學特征的關系。方法采用免疫組織化學、RT-PCR及Western blot分別檢測Ang-2及Tie-2在60例正常宮頸及宮頸癌組織中的組織定位、基因差異表達及蛋白差異表達；采用Spearman法分析Ang-2及Tie-2的表達相關性。結果宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。Ang-2及Tie-2在淋巴結發生轉移或臨床分期Ⅲ～Ⅳ級的患者中的表達明顯高于未發生淋巴結轉移或臨床分期Ⅰ～Ⅱ級的患者（均P＜0.05）。宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2 mRNA及蛋白表達水平均明顯高于正常宮頸組織，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。Tie-2與Ang-2在宮頸癌組織中的表達呈正相關(r=0.847 9，P＜0.01)。結論Ang-2及Tie-2的表達水平與宮頸癌臨床分期和有無淋巴結轉移密切相關，且Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白在宮頸癌組織中的表達明顯高于正常宮頸組織，Ang-2及Tie-2可能在宮頸癌發生、發展過程中發揮重要作用。

血管生成素-2 受體 Tie-2 宮頸腫瘤

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅廣大婦女的健康[1]。迄今為止，腫瘤新生血管學說是目前公認的宮頸癌發病機制之一。血管生成素（angiopoietin，Ang）是一種與血管生成密切相關的蛋白質，在腫瘤形成過程中對血管形成、穩定、轉移和退化起重要作用。其中血管生成素-2（Ang-2）和它們的共同受體內皮細胞特異性酪氨酸激酶受體（Tie-2）與血管生成密切相關[2-3]。本研究應用免疫組織化學、RT-PCR及Western blot法檢測宮頸癌組織中Ang-2及其受體Tie-2的表達情況，進一步探討Ang-2及其受體Tie-2表達與宮頸癌組織發生、發展及與臨床病理學特征的關系，以期用于解釋宮頸癌的發病機制，探索潛在的干預措施。

1 對象和方法

1.1 對象選取2008至2015年本院收治的宮頸癌患者60例作為實驗組，患者年齡35～51（43±5.02）歲；根據2009年宮頸癌FIGO分期[4]，Ⅰa期4例，Ⅰb期8例，Ⅱa期12例，Ⅱb期14例，Ⅲ～Ⅳ期22例；按WHO病理組織學分型：鱗狀細胞癌46例，腺癌14例；按淋巴結轉移：淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移44例；按病理分化程度：高分化18例，中分化28例，低分化14例。同時選取婦產科因子宮肌瘤等良性疾病行子宮完全切除術，且病理檢查證實無其他宮頸疾病婦女的正常宮頸上皮組織60例作為對照組，患者年齡37～49（41.25±4.83）歲。納入標準：（1）宮頸癌的診斷、臨床分期及病理分型均符合《2012NCCN子宮腫瘤臨床實踐指南（第2版）》[5]中的標準；（2）全部患者進行宮頸部位病理取材前均未施行放化療及生物、免疫治療；（3）本研究獲醫院倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2 主要儀器及試劑全自動免疫組化染色儀為德國Leica公司Bond-Max型；實時定量PCR儀為美國ABI公司7500型；蛋白印跡電泳設備為美國Bio-Rad公司Mini-PROTEANRTetra型。兔抗人多克隆抗體Ang-2、Tie-2均購自英國abcam公司，工作濃度分別為1∶200、1∶100；EnVision試劑盒（批號：1510130015）購自福建邁新生物技術有限公司；Ang-2、Tie-2引物由北京奧康生物技術公司設計；RT-PCR一步法反轉錄試劑盒（批號：210212）購自德國Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學收集相應病例的存檔蠟塊，行4μm連續切片，取1張行HE染色，其余行免疫組化EnVision法檢測。實驗步驟：（1）組織石蠟切片4μm，65℃烤片過夜；（2）脫蠟直至水化；（3）3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶10min；（4）PBS每次沖洗2min，3遍；（5）抗原熱修復，EDTA pH=9.0加溫20min；（6）重復步驟（4），3遍；（7）室溫下羊血清工作液封閉10min；（8）一抗室溫孵育60min；（9）重復步驟（4）；（10）即用型廣譜二抗室溫孵育25min；（11）重復步驟（4）；（12）即用型DAB顯色液顯色7min；（13）重復步驟（4）；（14）蘇木素復染、藍化、系列梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固切片。結果判斷：陽性顏色呈棕黃色顆粒，主要表達在腫瘤細胞胞質內，隨機觀察10個高倍鏡視野，平均每個高倍鏡視野的陽性細胞≥5%，即判斷為陽性[6]。

1.3.2 組織基因表達檢測采用RT-PCR法檢測正常宮頸組織及宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2的表達。Trizol一步法提取總RNA，以β-actin作為內參，進行總RNA定量和純度分析。逆轉錄反應按照試劑說明書操作。Ang-2的上游引物：5′-CTTATGAGCGAGAATGGG-3′，下游引物：5′-TAGGTTGTTGGGTTGTTT-3′，擴增產物長度181bp；Tie-2的上游引物：5′-AACTTGACTTCGGTGCTA-3′，下游引物：5′-TGAACCTTGTAACGGATAG-3′，擴增產物長度245bp；β-actin的上游引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，擴增產物長度250bp。PCR反應條件為：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，28個循環。取5μl PCR產物，2.0%瓊脂糖/溴化乙錠凝膠電泳。UVP凝膠密度掃描儀及其分析軟件（UVP，Inc.）進行半定量分析。

1.3.3 組織蛋白表達檢測采用Western blot法取液氮保存的正常或宮頸癌組織，根據質量/體積比1∶6加入尿素裂解液，冰上勻漿處理15s，重復5次，每次間隔10s，冰上裂解1h，4℃14 000×g離心20min，上清液即為組織總蛋白。Bradford法檢測蛋白濃度。12%SDSPAGE電泳分離蛋白，半干法轉印至PVDF膜（40mA 2h），用含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1h，分別將一抗Ang-2（兔抗1∶200）、Tie-2（兔抗1∶100）和β-actin（兔抗1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（羊抗兔1∶2 000）37℃50min，ECL顯影，凝膠成像系統掃描。通過軟件測定其灰度值，同一樣本的Ang-2/Tie-2與β-actin灰度比值作為該樣本Ang-2/Tie-2的相對量，用于統計學分析。

1.4 統計學處理采用SPSS 21.0統計軟件；計數資料比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗。Tie-2與Ang-2在宮頸癌組織中的表達相關性分析采用Spearman秩相關。

2 結果

2.1 Ang-2及Tie-2在正常宮頸及宮頸癌組織中的表達情況Ang-2及Tie-2陽性顆粒均主要表達于腫瘤細胞的胞質中，見圖1。宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。Ang-2及Tie-2在淋巴結發生轉移或臨床分期Ⅲ～Ⅳ級的患者中的表達明顯高于未發生淋巴結轉移或臨床分期Ⅰ～Ⅱ級的患者（均P＜0.05），但與患者年齡、病理組織學分型及腫瘤分化程度無關（均P＞0.05），見表2。

2.2 正常宮頸及宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2 mRNA的表達情況宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2 mRNA表達水平均明顯高于正常宮頸組織，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表3和圖2。

2.3 正常宮頸及宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2蛋白的表達情況宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2蛋白表達水平均明顯高于正常宮頸組織，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表4和圖3。

圖1 Ang-2及Tie-2陽性顆粒均主要表達于腫瘤細胞的胞質中[a：正常宮頸組織中Ang-2（-）；b：宮頸癌組織中Ang-2（+）；c：正常宮頸組織中Tie-2（-）；d：宮頸癌組織中Tie-2（+）；HE染色，×400]

圖2 Ang-2及Tie-2 mRNA在正常宮頸及宮頸癌組織中的表達情況

表1 Ang-2及Tie-2在不同宮頸組織中的表達情況[例（%）]

表2 Ang-2及Tie-2的表達及與臨床病例特征的關系[例（%）]

表3 正常宮頸及宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2 mRNA的表達情況

2.4 Ang-2與Tie-2在宮頸癌組織中的表達相關性Ang-2與Tie-2在宮頸癌組織中的表達呈正相關（r= 0.847 9，P＜0.01），見圖4。

圖4 Ang-2與Tie-2在宮頸癌組織中的表達相關散點圖

3 討論

腫瘤的增殖和轉移依賴于腫瘤血管的生成[6-7]。血管生成是多因素相互作用的結果。腫瘤組織中血管生長因子與抑制因子調節失衡，促生長因子表達相對增高，血管穩定性降低[2]。已發現的血管生長因子包括Ang、血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶家族等[8-9]。已有文獻報道VEGF參與宮頸癌的血管生成和淋巴管生成，其通過誘導血管形成，調節免疫細胞的活性而促進腫瘤細胞的轉移[10-11]，然而關于Ang家族在宮頸癌發病機制中的功能目前尚不明確。

表4 正常宮頸及宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2蛋白的表達情況

圖3 正常宮頸及宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2蛋白的表達情況

Ang家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4四個異構體。其中Ang-1、Ang-2與血管生成的關系最為密切，生物學功能相反[10]。Ang-1主要維持血管成熟和穩定，不參與腫瘤起始[12]；Ang-2與內皮細胞特有的激酶受體Tie-2結合后不引起后者的磷酸化，離斷血管內皮細胞與周圍細胞的連接，引起血管的不穩定，參與腫瘤新生血管的形成過程[8,13]。已有研究證實，Ang-2/Tie-2系統對乳腺癌[12]、肺癌[14]等腫瘤血管新生起重要調節作用，然而在宮頸癌發病中尚缺乏系統性的研究。

本研究首先應用免疫組化方法系統性研究Ang-2/Tie-2系統的關鍵因子Ang-2及Tie-2的表達，進而闡明Ang-2/Tie-2系統在宮頸癌發病中的作用。研究發現Ang-2及Tie-2均表達于正常宮頸及宮頸癌細胞的胞質中，而在宮頸癌組織中的表達明顯升高。同時結合患者臨床特征進行統計學分析發現，Ang-2及Tie-2的表達與宮頸癌的淋巴結轉移和臨床分期密切相關，淋巴結發生轉移或者臨床分期Ⅲ～Ⅳ級的患者Ang-2及Tie-2陽性率明顯高于未發生淋巴結轉移或臨床分級Ⅰ～Ⅱ級的患者，進而說明Ang-2及Tie-2的過度表達易發生盆腔淋巴結轉移和腫瘤浸潤。然而根據本研究實驗數據，目前尚無充分依據證明Ang-2及Tie-2的表達與患者年齡、組織學類型及腫瘤分化程度相關，提示Ang-2/Tie-2系統可能與宮頸癌發病年輕化無明顯相關性。進一步應用RT-PCR及Western blot法分別從基因及蛋白水平檢測正常宮頸及宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2的表達情況，結果提示宮頸癌組織中Ang-2及Tie-2基因和蛋白均顯著高表達，且相關性分析發現，兩者在宮頸癌組織中的表達呈正相關，高度提示Ang-2及其受體Tie-2可能聯合參與了宮頸癌腫瘤血管的發生。

綜上所述，本研究結果可初步提示Ang-2及Tie-2與宮頸癌的發生、發展、浸潤和轉移有關；Ang-2及Tie-2很可能通過影響腫瘤及周圍組織血管生成促進宮頸癌的生長。隨著分子生物學的發展，我們有望從基因水平阻斷Ang-2及Tie-2的表達，這可能將成為治療宮頸癌的新靶點。

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Expression of Ang-2 and Tie-2 in cervical cancer

DAI Zhenzhen,CHEN Kaiying,ZHU Hongxian,et al.Department of Pathology, Yinzhou People’s Hospital,Ningbo 315040,China

ObjectiveTo investigate the expression of angiopoietin-2(Ang-2)and its receptor Tie-2(Tie-2)in cervical cancer and their clinical significance.MethodsThe protein and mRNA expressions of Ang-2 and Tie-2 in 60 cervical cancer tissue samples and 60 normal cervical tissue samples were detected by immunohistochemical technique,RT-PCR and Western blot,respectively.The association between Ang-2,Tie-2 expression and clinical features was analyzed by Spearman analysis. ResultsAng-2 and Tie-2 were detected in the cytoplasm of cancer cells.The expression of Ang-2 and Tie-2 were significantly higher in cervical cancer tissues than that in normal tissues(all P＜0.05).The expression of Ang-2 and Tie-2 was significantly higher in patients with lymph node metastasis and clinical stage III-IV than that in patients without lymph node metastasis and with clinical state I-II(all P＜0.05).Expression of Ang-2 was positively correlated with expression of Tie-2(r=0.847 9,P＜0.01). ConclusionThe expressions of Ang-2 and Tie-2 are up-regulated in cervical cancer,particularly in late stage cancer with lymph node metastasis,which indicates that Ang-2 and Tie-2 may play an important role in the progress of cervical cancer.

Angiopoietin-2ReceptorTie-2Cervical neoplasm

2016-12-21）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-2166

寧波市鄞州區農業與社會發展領域科技項目

315040寧波市鄞州人民醫院病理科（戴珍珍、鐘國平、顧昕），婦產科（陳凱英、朱紅賢）

陳凱英，E-mail：958025950@qq.com