沉默Calnexin 基因表達對胃癌細胞SGC- 7901 內質網應激凋亡及其信號通路的影響

張曉海 張洪濤 胡孝定 鐘華

沉默Calnexin 基因表達對胃癌細胞SGC- 7901 內質網應激凋亡及其信號通路的影響

張曉海 張洪濤 胡孝定 鐘華

目的探討沉默鈣連蛋白（Calnexin）基因對胃癌細胞SGC-7901內質網應激凋亡信號通路的影響。方法構建靶向Calnexin基因的慢病毒干擾載體，利用包裝細胞293T獲得重組慢病毒，轉染人胃癌SGC-7901細胞，并分為轉染shRNA-Calnexin的實驗組，轉染shRNA空白質粒的空白載體組，并將未轉染的SGC-7901細胞作為對照組。應用RT-PCR技術檢測靶向沉默Calnexin的表達，應用四甲基偶氮唑藍（MTT）檢測各組細胞增殖情況；流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況；Western blot檢測GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達水平。結果轉染shRNA沉默Calnexin基因可明顯下調Calnexin mRNA的表達，實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MTT法檢測實驗組細胞轉染后細胞增殖能力明顯下降（P＜0.05）；沉默Calnexin基因可提高細胞凋亡率，轉染72h后實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沉默Calnexin基因使胃癌細胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP蛋白表達水平明顯升高（均P＜0.05）。結論靶向沉默Calnexin基因抑制人胃癌細胞增殖和促進細胞凋亡可能是通過抑制內質網應激信號通路實現的。

鈣連蛋白 SGC-7901 細胞 慢病毒 內質網應激 凋亡 胃癌

在我國每年大約有50萬新發(fā)胃癌患者，病例數占全球的1/2，胃癌在惡性腫瘤中發(fā)病率、死亡率均為第3位。目前我國對于胃癌的治療手段主要為手術治療及化療，但上述治療方法并不能達到患者及醫(yī)生的期望療效，且具有5年生存率低、不良反應大等特點[1]。鈣連蛋白（Calnexin）是內質網中的I型跨膜蛋白，具有輔助糖蛋白折疊裝配、監(jiān)控內質網折疊蛋白質量、調節(jié)細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)和緩解內質網應激（endoplasmic reticulum stress, ERS）等作用[2]。已有研究發(fā)現，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中，ERS現象普遍存在[3]，并且ERS選擇性地保留了對ERS有拮抗傾向的細胞，使存活下的腫瘤細胞向更惡性的方向進展[4]。基于上述研究，本研究提出下調Calnexin基因表達，干擾Calnexin/Calreticulin循環(huán)，使腫瘤細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)及錯誤蛋白降解能力失衡，促進原本耐受ERS的腫瘤細胞向凋亡路線傾斜。本研究觀察了胃癌細胞SGC-7901沉默Calnexin基因后，對ERS下游凋亡相關因子GRP94、IRE1、ATF6及CHOP的表達，為胃癌的靶向治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料SGC-7901細胞（ATCC公司，美國）；光學顯微鏡（BX51，Olympus公司，日本）；一氧化氮檢測儀（NO-501，IMN，日本）；水平搖床（WD-9405B，六一公司，中國）；GRP94、IRE1、ATF6及CHOP抗體（Boster公司,中國）、β-actin內參抗體（wanleibio公司，中國）；Annexin V細胞凋亡試劑盒（SIGMA，美國）；RPMI 1640（GIBCO，美國）；流式細胞儀（LSR-Ⅱ，BD公司，美國）。

1.2 構建針對Calnexin基因的shRNA慢病毒載體采用Ambion公司的設計軟件,針對人Calnexin的mRNA（NM 014062）設計4條siRNA序列,經過構建質粒，轉染293T細胞,根據其對Calnexin基因的抑制效率，確定有效RNAi序列為：sense：5′-CACAGCAACCACTTCCCTTC-3′，設計為短發(fā)卡shRNA序列合成并退火成雙鏈。慢病毒的骨架質粒pLVTHM經BamHI和EcoRI雙酶切消化后與雙鏈DNA進行連接反應,進行PCR鑒定,連接成功的載體送基爾頓生物科技公司進行菌種培養(yǎng)擴增并抽提質粒DNA。

1.3 shRNA慢病毒顆粒包裝出毒對數生長期的293T細胞接種于25ml細胞培養(yǎng)皿,細胞密度約70%時將重組的慢病毒骨架質粒與包裝輔助質粒用磷酸鈣共轉染至病毒包裝細胞293T,培養(yǎng)12h后棄去含有轉染混和物的培養(yǎng)液,加入新鮮的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。收集轉染72h的293T細胞上清液，于4℃，4 000g離心10min以去除細胞碎片，0.45μm濾器過濾后置于25 000r/min超速離心90min，而后以冰PBS液重懸病毒沉淀，分裝置于-80℃冰箱保存，該實驗步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.4 細胞培養(yǎng)與分組SGC-7901細胞加入到10%滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中（條件：37℃；5%體積分數CO2；飽和濕度，每2～3天傳代1次）。將細胞懸濁液以5×104/孔的密度接種于24孔板，細胞融合80%～90%進行轉染，將細胞分為對照組（未轉染的SGC-7901細胞）、空白載體組（轉染shRNA空白質粒）、實驗組（轉染shRNA-Calnexin的胃癌細胞）。

1.5 細胞轉染（1）取出冷藏保存的病毒，并輕輕搖勻；（2）感染目的細胞：觀察細胞生長狀態(tài)，細胞貼壁，狀態(tài)良好則開始實驗；（3）用移液器精準吸出10倍于細胞的病毒液加入培養(yǎng)基中；（4）加入ploybrene（8μg/ml）液體，加入培養(yǎng)基中以提高感染效率；（5）混勻后在37℃、5%CO2濃度條件的培養(yǎng)箱中孵育過夜；（6）孵育24h后將培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)液，在原有條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h[5]，該實驗步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.6 采用RT-PCR檢測Calnexin基因表達引物信息：Calnexin F：5′-GAAGGGAAGTGGTTGCTGTG-3′，R：5′-CGTCTTTCTTGGCTTTGGAT-3′。經過總RNA提取后進行RNA濃度檢測，將得到的RNA樣本進行反轉錄得到對應的cDNA。在冰浴的無核酸酶的離心管中加入反應混合物，加熱條件：70℃加熱5min，冷卻2min。離心后加入5×Buffer（4μl）、RNasin（0.5μl）、1μl M-MLV，輕輕混勻。25℃溫浴10min，42℃溫浴50min，95℃加熱5min，終止反應。經由PCR儀完成上述過程，可得20μl cDNA，待PCR循環(huán)結束后，馬上升溫至95℃，維持10min，再降至60℃，維持20s；從60℃提升至72℃，維持30s，最后降至4℃維持5min，此過程循環(huán)40次。每個樣品基因行6個復孔平行實驗，實驗結果舍去較大誤差數值后選取剩余值平均值為實驗數據，實驗結果采用2-△△CT法分析數據，該實驗步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.7 采用四甲基偶氮唑藍（MTT）檢測各組細胞增殖率取各組轉染24h細胞，實驗前用臺盼藍拒染法確認SGC-7901細胞拒染率在95%以上，調整細胞數為4× 107/L，取200μl接種于96孔板中（每組細胞5個復孔），設對照組、空白載體組、實驗組，培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入5g/L MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后去上清液，逐一加入DMSO 100μl后震蕩混勻，待藍色晶體完全溶解反應后，應用酶標儀測定570nm處的吸光度值（OD值），并計算抑制率。抑制率=（1-實驗組OD值/空白對照組OD值）×100%[6]。該實驗步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.8 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡分別收集72h培養(yǎng)的SGC-7901細胞，經過消化、PBS沖洗、懸浮、300目尼龍網過濾細胞后加入300μl的Binding Buffer懸濁細胞，加入5μl的Annexin V-FITC混合，再加入Propidium Iodide并充分混勻；常溫下避光反應20min；采用流式細胞儀檢測并應用軟件分析結果，該實驗步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.9 Western blot檢測各組胃癌細胞內GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達分別收集72h培養(yǎng)的SGC-7901細胞，制備組織勻漿，Western blot檢測步驟：蛋白質抽提→蛋白質定量→SDS-PAGE→轉印至PVDF膜→封閉→孵育一抗→孵育二抗→ECL底物發(fā)光→圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液。檢測各組細胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP的表達[7]。該實驗步驟由浙江省皮膚病防治研究所自行研究完成。

1.10 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 采用RT-PCR檢測Calnexin基因表達經RTPCR檢測，對照組細胞中Calnexin mRNA水平為1.00± 0.02，實驗組細胞中Calnexin mRNA水平為0.35±0.01，明顯減少，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而空白載體組（1.02±0.01）與對照組比較，Calnexin mRNA水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組細胞增殖的影響MTT法檢測細胞增殖情況顯示，與對照組比較，實驗組Calnexin基因沉默后對胃癌細胞SGC-7901抑制生長作用明顯，且培養(yǎng)時間越長，抑制作用越明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白載體組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 各組細胞凋亡的影響與對照組比較，實驗組細胞凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而空白載體組與對照組比較，細胞凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1和圖1。

表1 沉默Calnexin基因對胃癌細胞SGC-7901增殖及凋亡的影響（n=6）

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況（a：對照組；b：空白載體組；c：實驗組）

2.4 各組細胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達沉默Calnexin基因后，與對照組比較，實驗組GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而空白載體組與對照組相比較上述蛋白表達，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2和圖2。

表2 各組細胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP的表達（n=6）

3 討論

在我國胃癌發(fā)現時多為中晚期，手術治療效果欠佳，臨床治療多以手術、化療相結合為主[8]。但化療藥物具有毒性反應強、且靶向性不明確、易產生耐藥性等缺點，在臨床應用中受到了諸多限制。因此，尋找高效、靶向治療胃癌的方法不僅是目前的研究熱點，更是亟待解決的問題。

圖2 各組細胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達電泳圖（a：對照組；b：空白載體組；c：實驗組）

胃癌細胞由于其自身瘋狂繁殖和處于高酸環(huán)境等特點，傳統(tǒng)抗癌藥物難以將胃癌細胞殺死。目前現代科學技術對于細胞的靶向誘導逐漸成熟，誘導腫瘤細胞凋亡已成為治療腫瘤的希望和研究熱點。ERS是近年來新發(fā)現的凋亡機制，現階段研究認為ERS發(fā)生的主要原因是內質網折疊蛋白功能異常，導致錯誤蛋白在內質網內堆積[4]，短時間的ERS是細胞自我修復的一種方法，但長期的ERS發(fā)生即可引起細胞凋亡。大量研究證實[8-9]，惡性腫瘤細胞瘋狂生長和繁殖，致使腫瘤細胞普遍缺氧并發(fā)生ERS，但發(fā)生ERS的腫瘤細胞并不走向凋亡，這可能與腫瘤細胞長期處于缺氧狀態(tài)已產生耐缺氧及ERS耐受有關[8]，減少腫瘤細胞對ERS的耐受性，使腫瘤細胞更傾向于凋亡，可能成為治療胃癌的新靶點。

Calnexin是內質網內穩(wěn)態(tài)體系的重要組成部分,即Calnexin/Calreticulin循環(huán)，可使錯誤折疊的糖蛋白重新折疊，而難以糾正構象的糖蛋白為避免在內質網過度堆積造成危害，則在內質網甘露糖苷酶I作用下從Calnexin/Calreticulin循環(huán)中釋放出來,與受體蛋白EDEM結合,后者通過Sec61p通道進入胞液,在泛素-蛋白酶體系中將其降解，這一過程稱為糖蛋白內質網相關性降解[10]。內質網分子伴侶蛋白GRP94與腫瘤細胞關系密切，姚元春等[11]通過免疫組化及分子生物學等技術研究發(fā)現GRP94在人胃癌組織中呈高表達狀態(tài)，并且與胃癌細胞侵襲力相關，可作為胃癌分期及惡性程度的檢驗指標。現階段公認的ERS信號通路共有（1）PERK→eIF2a→ATF-4→CHOP；（2）IRE1→CHOP；（3）ATF6→CHOP等3條，誘導CHOP、Caspase-3及JNK因子的表達及活化，驅使細胞凋亡。雖然已有研究證實，Calnexin與ERS的發(fā)生有關[12]，但尚未有研究報道Calnexin的表達是否可以干擾胃癌細胞這種長期耐受ERS的“特能細胞”的增殖速度及凋亡情況。

慢病毒載體的研究發(fā)展迅速，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體且成功率較高[13]，本研究通過慢病毒介導干擾RNA沉默Calnexin基因表達，并用RT PCR技術驗證Calnexin基因沉默效果，觀察干擾后胃癌細胞增殖及凋亡情況，以了解Calnexin基因與胃癌細胞生存的關系。MTT結果顯示，沉默Calnexin基因后胃癌細胞增殖受到抑制，并且凋亡率增加，為了探討胃癌細胞增殖抑制的機制，本研究進一步采用Western blot檢測ERS標志物GRP94及ERS信號通路。研究結果顯示，當Calnexin基因沉默時，GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達增加，這說明Calnexin基因沉默可使ERS標志物GRP94表達更高，打破胃癌細胞原本對ERS耐受的平衡，并且通過IRE1→CHOP、ATF6→CHOP通路誘導胃癌細胞凋亡。

綜上所述，本研究雖然證實沉默Calnexin基因可通過IRE1→CHOP/ATF6→CHOP通路誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡、抑制細胞增殖，但對于胃癌細胞其他凋亡通路的影響、分裂周期時相的分布尚不得而知，下一步研究將更深入地挖掘Calnexin基因對胃癌細胞的影響，為胃癌的臨床治療提供新靶點和新思路。

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Effectsof calnexin silencing on endoplasmicreticulum stress-apoptosisand itssignaling pathway in gastriccancer cellline SGC-7901

ZHANG Xiaohai,ZHANG Hongtao,HU Xiaoding,etal.Departmentof Internal Medicine,Zhejiang Skin Disease Prevention and Treatment Center,313200Deqing,China

ObjectiveTo investigate the effects of calnexin gene silencing on endoplasmic reticulum stress-apoptosis and its signaling pathway in gastric cancer SGC-7901cells.MethodsLentiviral vectors for short hairpin RNAs targeting the coding region of human calnexin gene were constructed.The recombinant lentiviral vectors were harvested from 293T cells and were used to transfect human gastric cancer SGC-7901 cells.SGC-7901 cells were transfected with shRNA-Calnexin (experimental group)or shRNA blank plasmid(blank vector group),and the non-transfected SGC-7901 cells were used as control group.Expression of calnexin mRNA in SGC-7901 cells were detected by RT-PCR,cell proliferation was detected by MTT,cell apoptosis was detected by flow cytometry,expression of GRP94,IRE1,ATF6 and CHOP were detected by Western blot.ResultsThe expression of Calnexin mRNA was down-regulated in experimental group compared to control group(P＜0.05),and the cell proliferation was significantly decreased(P＜0.05).The apoptosis rate was increased 72h after transfection, compared with the control group(P＜0.05).The expression of GRP94,IRE1,ATF6 and CHOP was significantly increased in experimental group(P＜0.05).ConclusionCalnexin silencing can inhibit cell proliferation and induce apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells probably by inhibiting endoplasmic reticulum stress signaling pathway.

CalnexinSGC-7901 cellSlow virusEndoplasmic reticulum stressApoptosisGastric cancer

2016-08-17）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-1304

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目（2013KYB076）

313200德清，浙江省皮膚病防治研究所內科

張曉海，E-mail：doczhangxiaohai@163.com