左乙拉西坦對癲癇小鼠內嗅皮層GABA神經元電生理干預的研究

倪紅 鄭卜真 王恩 馬傳花 柯紹發 周元林 金笑平 儲照虎

左乙拉西坦對癲癇小鼠內嗅皮層GABA神經元電生理干預的研究

倪紅 鄭卜真 王恩 馬傳花 柯紹發 周元林 金笑平 儲照虎

目的研究癲癇小鼠內嗅皮層γ-氨基丁酸（GABA）能神經元的電生理變化及使用左乙拉西坦（Lev）干預治療后的電生理變化。方法將綠色熒光蛋白轉基因（FVB-Tg）小鼠隨機分為對照組、模型制備組和Lev干預組。Lev采用灌胃給藥。在造模成功后直接斷頭取腦，制作腦片，在人工腦脊液中孵育后，利用膜片鉗技術，進行全細胞記錄。觀察并比較3組小鼠大腦內嗅皮層GABA能神經元動作電位的閾電位（Vts）、靜息膜電位（Vr）、絕對不應期（ARP）和動作電位間距（ISI）。結果模型制備組ARP值較對照組和Lev干預組延長，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；Lev干預組較對照組僅ARP4比較差異有統計學意義（P＜0.05）。模型制備組Vts-Vr值較對照組明顯延長，但Lev干預組Vts-Vr值較對照組及模型制備組明顯縮短，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。模型制備組ISI值較對照組和Lev干預組延長，差異均有統計學意義（均P＜0.05），Lev干預組與對照組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。結論Lev干預能使癲癇小鼠內嗅皮層GABA能神經元Vts-Vr、ARP、ISI縮短，有增強GABA能神經元興奮性和編碼能力的作用。

左乙拉西坦 癲癇 內嗅皮層 GABA神經元

癲癇是一組由大腦神經元異常放電所引起的短暫中樞神經系統功能失常為特征的慢性腦部疾病，是一種常見的神經系統疾病。顳葉癲癇是難治性癲癇的主要類型，病灶主要位于顳葉內側的邊緣系統結構如海馬、內嗅皮層、嗅周皮層及杏仁核等。Baicia等[1]經微透析技術將γ-氨基丁酸（GABA）灌注到大鼠杏仁核后，癲癇發作的持續時間縮短，同時導致病灶的后發作和發作閾值明顯提高，說明了GABA對癲癇發作的抑制作用。因此GABA能神經元成為研究抗癲癇使用藥物作用靶點[2]的熱點。左乙拉西坦（levetiracetam,Lev）是比利時UCB公司研發的具有全新抗癲癇機制的抗癲癇藥物。Palma等[3]提出Lev的抗癲癇作用可能與GABA受體敏感性有關。Ueda等[4]研究發現Lev能阻斷大腦皮層GABA能神經元受體下調，并將下調的受體滯留于海馬而增強GABA對神經元回路的抑制作用，但具體機制尚不明確。本實驗選擇急性癲癇小鼠內嗅皮層GABA能神經元作為研究對象，利用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）標記GABA能神經元，研究GABA能神經元在癲癇發作前后的電生理變化，了解GABA能神經元興奮性與癲癇發作之間的關系；并對比使用Lev干預處理后，GABA能神經元電生理的變化，了解Lev干預后GABA能神經元的電生理改變，為Lev應用于癲癇及難治性癲癇提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物的選擇健康GFP轉基因[FVB-Tg（Gad GFP）4 570Swn/J]小鼠30只，出生后15～17d，購于中國科學院生物物理研究所。

1.2 實驗分組將30只FVB-Tg小鼠隨機分為對照組、模型制備組和Lev干預組各10只。Lev干預組在致癲前48h開始腹腔注射給藥，200mg/（kg·d）分2次給藥。模型制備組和對照組同時予0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3 動物模型建立取FVB-Tg小鼠，腹腔注射東莨菪堿1mg/kg，30min后向小鼠腹腔注射匹魯卡品30mg/kg，若注射30min后仍然未誘發Ⅲ級以上癇性發作，可重復給予原劑量匹魯卡品，以5次為最高限，V級發作持續1h示為模型建立成功。

1.4 癇性發作分級標準小鼠癇性發作分級標準按Racine標準：0級無驚厥，Ⅰ級面部陣攣，Ⅱ級面部陣攣+節律點頭，Ⅲ級面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣，Ⅳ級面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立，V級面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒。

1.5 膜片鉗GABA能神經元電位記錄

1.5.1 腦片制備腹腔注射20g/L戊巴比妥0.1ml麻醉小鼠，取出大腦，在充分氧合的冰水混合人工腦脊液中行冠狀切片，厚度400μm，腦片被孵育在25°C氧飽和的人工腦脊液（124mmol/L氯化鈉，3mmol/L氯化鉀，1.2mmol/L磷酸二氫鈉，26mmol/L碳酸氫鈉，2.4mmol/L氯化鈣，1.3mmol/L硫酸鎂，10mmol/L右旋葡萄糖，5mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.35）[5]中1～2h。然后轉移到31°C氧飽和的人工腦脊液灌流的記錄槽中（180μl，Warner RC-26G）進行膜片鉗全細胞電位記錄（圖1）。

圖1 電鏡下的膜片鉗與GABA能神經元胞體

1.5.2 GABA能神經元的選擇因將GFP基因插入該小鼠谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）基因下游，故GABA能神經元在熒光顯微鏡藍光（488nm）的激發下發出綠色熒光，以此可與其他神經元相鑒別。本實驗結合內嗅皮層解剖結構，定位選擇內嗅皮層的熒光標記GABA能神經元。

1.5.3 GABA能神經元電位記錄采用Axoclamp-200B放大器，放大器的高頻濾波為3kHz。在膜片鉗全細胞電位記錄模式下采集電信號，輸入pClamp 9.2進行分析。全細胞電位記錄的電極管內充滿標準電極液，滲透壓為295～305mOsmol，電極阻抗為5～6MΩ。先利用去極化刺激，記錄前4次動作電位的絕對不應期（absolute refractory period，ARP）。再使用長時程電流脈沖（300ms），分別記錄前5次動作電位的閾電位（threshold potential，Vts）、靜息膜電位（resting membrance potential，Vr）和動作電位間距（inter-spike interval，ISI）。神經元能障以Vts與Vr的差值(Vts-Vr）表示。記錄的神經元電位，以刺激的順序表示，僅當細胞膜靜息膜電位負值超過-70mV時，所得資料才用于統計分析，其Vr、動作電位幅度和輸入阻抗的波動范圍在5%之內的數據也認為在標準范圍內而被采用。

1.6 統計學處理采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Sigmaplot 10.0統計軟件繪圖。

2 結果

2.1 3組內嗅皮層GABA能神經元APR的變化3組內嗅皮層GABA能神經元ARP值比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較發現，模型制備組ARP值較對照組和Lev干預組延長，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；對照組與Lev干預組僅ARP4比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1和圖2。

表1 3組內嗅皮層GABA能神經元連續發放動作電位的ARP1～4值變化（ms）

圖2 3組內嗅皮層GABA能神經元ARP1～4值變化圖

2.2 3組內嗅皮層GABA能神經元Vts-Vr的變化3組內嗅皮層GABA能神經元Vts-Vr值比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較發現，模型制備組Vts-Vr值較對照組和Lev干預組明顯延長，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；Lev干預組Vts-Vr值較對照組縮短，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2和圖3。

圖3 3組內嗅皮層GABA能神經元Vts-Vr變化圖

表2 3組內嗅皮層GABA能神經元Vts-Vr值的變化（mV）

2.3 3組內嗅皮層GABA能神經元ISI的變化3組內嗅皮層GABA能神經元ISI值比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較發現，模型制備組ISI值較對照組和Lev干預組延長，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；Lev干預組與對照組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3和圖4。

表3 3組內嗅皮層GABA能神經元ISI值的變化（ms）

圖4 3組內嗅皮層GABA能神經元ISI值變化圖

3 討論

癲癇的發病機制一直是近年來研究的熱點，目前人們普遍認為癲癇的發生是由于興奮性神經元的活性和谷氨酸的釋放量增高或抑制性神經元的活性和GABA的釋放量降低造成的。GABA是中樞神經系統最主要的抑制性神經遞質，各類癲癇的發生幾乎都與腦內GABA的功能變化有關。本研究采用匹魯卡品建立癲癇實驗動物模型，利用膜片鉗全細胞記錄的電生理學技術，研究位于內嗅皮層的GABA能神經元的電生理改變。通過研究發現在相同刺激強度、刺激時間作用下癲癇小鼠內嗅皮層的群集動作電位的內在特性及編碼能力發生了可塑性變化，表現為模型制備組GABA能神經元動作電位的Vts-Vr、ARP、ISI均較對照組延長，說明癲癇后GABA能神經元動作電位不應期延長，閾電位水平升高，群集動作電位的發放容量降低。ISI升高表明癲癇后GABA能神經元發放的動作電位個數減少，即興奮性降低，精確性下降。不應期的延長意味著在一定的時間內給細胞特定的刺激，細胞在單位時間內動作電位發放的個數減少，即發放頻率降低，這使動作電位發放容量降低。Vts-Vr是靜息電位上升到閾電位的能障，能更好地顯示突出輸入是如何驅動神經元激發動作電位產生的。該值增大說明癲癇后GABA能神經元接受外來信號刺激后，細胞由靜息狀態到激發動作電位產生的充電過程延長，跨越的能障增大，GABA能神經元對刺激動作電位產生的興奮性輸入反應不敏感，細胞功能受到抑制。癲癇后大腦皮層GABA能神經元發放動作電位的不應期延長和閾電位升高，內在特性的改變使大腦皮層GABA能神經元對動作電位編碼的控制能力降低，從而使大腦皮層GABA能神經元受到抑制和動作電位發放的精確性下降。上述變化可能使皮層抑制性和興奮性兩大類神經元間的動態平衡遭到破壞，進而導致大腦功能發生紊亂，引起行為變化。動作電位的不應期和閾電位由電壓門控的動力學控制[6]。癲癇造成GABA能神經元內在電生理的改變，可能是由于電壓門控的活性降低所致。通過神經元電生理參數的量化有助于對神經信號編碼的研究[7-9]。

Lev具有廣譜抗癲癇藥的特點，其適應證及使用人群逐漸擴大，特別是在難治性局灶性癲癇發作方面。Klit-gaard等[10]報道在急性最大電休克癲癇模型和戊四唑誘導的急性癲癇模型中，Lev幾乎不發揮抗驚厥作用，但在匹羅卡品和紅藻氨酸藥物誘發的顳葉癲癇中能夠減少海馬神經元死亡，顯示出神經保護作用，且在大劑量時對動物行為影響極小，說明其特殊的抗癲癇機制和安全性。本研究通過Lev干預對癲癇小鼠內嗅皮層GABA能神經元電生理的研究發現：（1）Lev干預組GABA能神經元動作電位的Vts-Vr、ARP、ISI較模型制備組明顯縮短。提示使用Lev干預后，內嗅皮層GABA能神經元興奮性較模型制備組升高、編碼能力增強，其抑制作用增強。（2）Lev干預組較對照組Vts-Vr縮短，但ARP、ISI無明顯差異，表明Lev干預后GABA能神經元興奮性與未發生癲癇小鼠接近，但Vts-Vr降低，其可興奮性有所增強。本研究進一步證實了Lev能增強癲癇發作時內嗅皮層GABA能神經元的抑制作用，但其增強內嗅皮層GABA能神經元的具體作用機制及其與海馬GABA能神經元之間的關系等，尚有待進一步研究。

綜上所述，本研究發現模型制備組GABA能神經元動作電位的Vts-Vr、ARP、ISI均較對照組延長，提示癲癇發作時GABA能神經元興奮性降低。Lev干預組GABA能神經元動作電位的Vts-Vr、ARP、ISI較模型制備組明顯縮短，說明Lev干預能使癲癇小鼠內嗅皮層GABA能神經元興奮性增強，有提高GABA能神經元編碼能力的作用。

[1]Baicia J A,Castillo A,Guti rrez R,et al.Continuous inatr-amygdalar infusion Of GABAin the amygdala kindling modelof epilepsy in rat[J].Epilepsy research,2005,58(1):19-26.

[2]Gassmann M,Bettler B.Regulation of neuronalGABA(B)receptor functions by subunit composition[J].Nat Rev Neurosci,2012,13 (6):380-394.doi:10.1038/nrn3249.

[3]Palma E,Ragozzino D,Di Angelantonio S,et al.The antiepileptic drug Leve tiracetam stabilizes the human epileptic GABA A receptors upon repetitive activation[J].Epilepsia,2007,48(10): 1842-1849.

[4]Ueda Y,DoiT,Nagatomo K.Effect of Levetiracetam on molecular regulation of hippocampal glutamate and GABA transporters in rats with chronic seizures induced by amygdalar FeCl3 injection [J].Brain Res,2007,1151(1):55-61.

[5]Li J,Baccei M L.Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons[J].Neurosci,2016,36(19):5405-5416.doi: 10.1523/JNEUROSCI.3547-15.2016.

[6]Zhang M,Hung F S,Zhu Y,et al.Calcium signal-dependent plasticity of neuronal excitability developed postnatally[J].Neurobiol,2004,61(2):277-287.

[7]Crochet S,Petersen C C.Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice[J].Nat Neurosci, 2006,9(5):608-610.

[8]Powell E M.Recipes for making human interneurons from stem cells require multiple factors,careful timing,and long maturation periods[J].Epilepsy Curr,2013,13(6):266-268.doi:10.5698/ 1535-7597-13.6.266.

[9]Bale M R,Ince R A,Santagata G,et al.Efficient population coding of naturalistic whisker motion in the ventro-posterior medial thalamus based on precise spike timing[J].Front Neural Circuits, 2015,9:50.doi:10.3389/fncir.2015.00050.eCollection 2015.

[10]Klit-gaard H,Verdru P.Levetiracetam:the first SV2A ligand for the treatment of epilepsy[J].Expert Opin Drug Discov,2007,2 (11):1537-1345.

Electrophysiological changes of GABAergic neurons of entorhinal cortex in epileptic mouse after levetiracetam intervention

NI Hong, ZHENG Buzhen,WANG En,et al.Department of Neurology,the Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University,Taizhou 317000,China

ObjectiveTo investigate the electrophysiological changes of GABAergic neurons in entorhinal cortex of epileptic mouse after levetiracetam intervention.MethodsTransgenic FVB-Tg mice were randomly divided into control group, model group,and levetiracetam group.The epilepsy model was induced by sequential injection of scopolamine and pilocarpine in TVB-Tg mice.Levetiracetam was given by intragastric administration.Tissue specimens of entorhinal cortex were obtained after animals were sacrificed.The brain slices(400μm)were prepared and incubated in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. The sequential spike patters(inter-spike intervals,ISI)and intrinsic properties(ARP,Vts,Vr)of GABAergic neurons were recorded by the whole-cell clamp and analyzed with pClamp 9.ResultsCompared to control groups,in model group the ARP was prolonged,the Vts-Vr increased,and the ISI was extended(all P＜0.05).Compared to model group,in levetiracetam group the ARP were significantly shortened(P＜0.05),the threshold potentials significantly decreased(P＜0.01),and the ISI was shortened (P＜0.05).ConclusionWith the intervention of levetiracetam,the spike encoding and intrinsic properties of GABAergic neurons were improved in epileptic mice,which suggests that the functional enhancement of GABAergic neurons may play an important role in epileptic control.

LevetiracetamEpilepticEntorhinal cortexGABAergic neuron

2014-11-28）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2014-1439

臺州市科技局資助項目（121ky08）

317000臨海，溫州醫科大學附屬臺州醫院神經內科（倪紅、王恩、馬傳花、柯紹發、周元林、金笑平）；臺州恩澤醫療中心（集團）恩澤醫院手足外科（鄭卜真）；安徽皖南醫學院弋磯山醫院神經內科（儲照虎）

儲照虎，E-mail：chuzhaohu787@126.com