曲妥珠單抗的高效液相色譜定量分析

張亞琴　王東偉

【摘 要】本文采用高效液相色譜法以磷酸鹽緩沖液為流動相，凝膠柱和紫外檢測器定量分析曲妥珠單抗注射液中曲妥珠單抗的藥物含量。結果表明曲妥珠單抗注射液濃度在10μg/mL～1mg/mL范圍內濃度與紫外吸收峰面積呈良好的線性關系，線性相關系數r≥ 0.99。

【關鍵詞】高效液相色譜；曲妥珠單抗；定量分析

曲妥珠單抗是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，選擇性地作用于人表皮生長因子受體-2（HER2）的細胞外部位。此抗體屬IgGl型，含人的框架區，及能與HER-2結合的鼠抗-p185 HER2抗體的互補決定區。本文所用的藥物為鋯89標記的曲妥珠單抗。

本文采用的是外標法定量分析鋯89標記的曲妥珠單抗注射液中曲妥珠單抗的藥物含量，已達到能基本了解注射入動物體內時的藥物含量。外標法操作簡單快鍵，影響其實驗結果的主要因素是進樣量的誤差對最終結果影響較大。

1 試劑和儀器

2 實驗方法

2.1 流動相配制

分別用電子天平稱取11.50g磷酸氫二鈉，2.96g磷酸二氫鈉，11.60g氯化鈉于1L的溶劑瓶中。用量筒量取1L超純水于瓶中，超聲震蕩并攪拌溶解。用抽濾裝置除去其中的顆粒狀雜質。

2.2 標準液配制

用電子天平精確稱量1mg的曲妥珠單抗于西林瓶中，用移液槍移取1mL超純水于西林瓶中，渦旋混勻器震蕩溶解配制為1mg/mL的標準液標注為1號標準液。用移液槍移取500μL上述標準液于另一個西林瓶中，再加入500μL超純水稀釋為500μg/mL的標準液，標注為2號標準液。按上述方法逐次稀釋分別配制250μg/mL、100μg/mL、10μg/mL標準液，分別標注為3、4、5號標準液。

2.3 HPLC的工作條件

流速為0.8mL/min，流動相為已配置的磷酸緩沖液。

檢測波長為280nm，進樣量30μL。

3 實驗結果

3.1 標準品HPLC數據

3.2 標準曲線

以標準液濃度為橫坐標，以紫外吸收峰面積為縱坐標建立標準曲線。如下圖1所示，濃度與峰面積呈線性關系，標準曲線方程為y=3422x+4246.1，相關系數R2=0.9952。

3.3 未知樣品的濃度

未知樣品的色譜圖如圖2所示，樣品的保留時間為11.910min，峰面積為708269。根據標準曲線方程計算位置樣品濃度x=（y-4246.1）/3422，最終計算結果為未知樣品濃度x=205.73μg/mL。

4 結果與討論

外標法建立標準曲線方程從而計算得出未知樣品的濃度是定量分析中一種常用的方法。但是也有很多的缺點和不足，其受到操作誤差的影響較大，進樣量以及柱效都對最終結果有很大的影響。

由標準液中濃度為10μg/mL的5號標準液的紫外吸收峰面積與標準曲線方程計算得到的紫外吸收峰面積的y值相比較，差距很明顯。再比較1號標準液和標準曲線方程計算值之間的差距，由此可以得出在越低濃度的情況下，標準曲線方程的精確度受到操作誤差的影響就越大。

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[責任編輯：田吉捷]