基于數字PCR熒光檢測儀的軟件系統設計模型

李鑫鑫　鄔少飛

【摘 要】數字PCR一般包括兩部分。即PCR的擴增和熒光信號分析。在PCR擴增階段。利用數字PCR先將樣品稀釋到單分子水平[1]，平均到幾十到幾萬個單元中進行化學反應，使得各個反應單元中目標分子是0或者1，使得目標分子陽性信號得以檢測。實驗會利用上端軟件控制實驗室其中一臺PCR子儀器的運行，對儀器中的數據進行采集，以及對科學采集到的數據進行分析和處理，便于對基因的定量分析和檢測。該軟件要控制其中一臺PCR儀器的運行和工作。另外這臺儀器會通過USB接口把采集的數據上傳到PC端，通過PC端的軟件程序進行分析和處理。最后得出實驗結論。

【關鍵詞】數字PCR；熒光檢測儀；數據分析；生命科學與計算機；儀器控制

The Software System Design Model Based on Digital PCR Fluorescence Detector

LI Xin-xin WU Shao-fei

（Wuhan Institute of Technology School of computer science and Engineering，Wuhan Hubei 430205，China）

【Abstract】Digital PCR generally includes two parts. That is， the PCR amplification and fluorescence signal analysis. In the PCR amplification stage. Using digital PCR to dilute samples onto a single molecule level[1]， the average to dozens to tens of thousands of units in chemical reaction， make each reaction unit of target molecules is 0 or 1， makes the target molecules positive signal detection. One of them will use the upper software control laboratory PCR instrument operation， instrument of the data acquisition， as well as to the scientific analysis and processing the data collected， is advantageous for the quantitative analysis of the gene and detection. The software to control one PCR instrument operation and work. In addition this instrument will collect data uploaded to PC through USB interface， through analysis and deal with the PC software. Finally experimental conclusions.

【Key words】Digital PCR； Fluorescence detector； Data analysis； Life sciences and computer； Instrument control

0 引言

社會在不斷地進步，人們的生活方式在提高，物質條件也在逐步改善，越來越多的人在享受高品質生活的同時，也愈加得關注個人的身體健康。數字PCR這種分子檢查技術除了用于疾病的預測及早期診斷外，還將用來指導人們的常規體檢，讓常規體檢更具有針對性，從而改變人們的健康管理的觀念。除此之外，它還可以用來指導人們管理疾病，進而指導病人安全用藥，可以幫助醫生規劃針對個體病人的治療措施，以便人們對疾病的治療更加有的放矢。

核酸分子的定量最常見的有三種方法；（1）利用核酸分子對光的吸收度的不同進行測量；（2）在PCR反應體系中添加熒光探針，用熒光信號來實時監控PCR反應過程，最后用標準曲線對未知模板處理[2]；（3）數字PCR將微量樣品進行大量分級的稀釋和分液處理，使待測分子數不超過1個，在進行PCR的擴增，使得含有1個目標分子的樣品放大至幾百萬倍，產生強大的熒光信號，對發生了擴增反應的樣品計數[3]。

1 數字PCR檢測原理

數字PCR是一種基于單分子模板PCR擴增，進行核酸拷貝數精確定量的分析方法[4]?；A原理如圖1所示：

圖1 PCR檢測的基礎原理

首先把樣品分散到獨立的反應單元，然后在一個板上進行多個獨立擴增反應，如熒光定量PCR一樣采用引物和熒光探針，陽性反應單元記為1，陰性反應單元記為0[5]。接著用軟件進行陽性及陰性反應單元數數，最后進行泊松分布的計算，得出最終擴增的拷貝數量。如圖2所示：

黑色小點代表陽性反應單元，白的小點代表陰性反應單元。根據泊松概率分布公式進行計算：

p=e（1）

其中：λ表示單位反應單元中DNA分子的平均數量；

p表示在λ的條件下，單位單元中所含有的k個 DNA分子的濃度；

設稀釋系數為m，則有λ=cm，c為樣品的原始數量。當k=0時，p =eλ=e-cm，與此同時，p=，n-f為沒有標記熒光時的分子反應數目，n為參與反應的分子總數目。所以：

=e-cm？陴cm=ln（1-）（2）

2 數字PCR熒光檢測儀的軟件模型設計

該軟件模型總體分為三個大塊：USB驅動和信號的檢測分析和處理模塊；包含特定算法的邏輯運算模塊；可視化的面板設置模塊?？傮w模塊設計如圖3所示。

其中USBManager主要功能：（1）USB數據的讀取和保存操作；（2）對數據處理（調用算法），并把峰值數據等保存到wellCtrl中；（3）顯示當前運行樣本的信息；（4）USB讀取異常處理；myMiniPlateCtrl（96孔板）主要功能：（1）選擇樣本；（2）更新畫圖和GridView顯示（3）保存選取樣本的設置。dataGridView主要功能：（1）把用戶選中樣本（孔）的每個通道的數據顯示；（2）把GridView顯示的樣本信息導出，并保存為Excel或CSV格式的文件。fileManager主要功能：（1）讀取和保存 Plate文件（2）讀取和保存TemplatePlate文件（3）讀取和保存 通道的.FCS文件（4）保存通道數據 至 wellCtrl類。

concentrationPage面板中的包含循環閾值（Cycle threshold）的設置，對于一個PCR反應，達到循環閾值時：

Nt=N0（1+E）（3）

其中，N0是初始模板的拷貝量，CT是循環閾值即擴增反應的循環次數，Nt是第CT個循環反應時產物的拷貝數。將上式兩邊分別取對數，得到：

計算出循環閾值

對于特定的PCR反應，理想情況下，擴增效率E和CT個循環反應的拷貝數Nt均為定值，因此CT值與初始模板拷貝數N0的對數成反比關系。

3 實驗

在實驗室的環境下，分別用兩組曲線圖來描述理想和非理想情況下PCR的反應曲線圖。理想情況下的PCR反應曲線圖：Nt=N0*2，其中橫坐標CT表示反應次數，縱坐標Nt是第CT個循環反應時產物的拷貝數。

圖4 理想情況下的PCR反應曲線圖

非理想情況下的PCR反應曲線圖：Nt=N0（1+E）CT。

4 結束語

數字PCR的市場前景大有可觀。各國科學家們致力于數字PCR的研發，已誕生了多種dPCR（Digital PCR）裝置，如液滴式、旋流片式、滑動芯片式、集成流路芯片式等。商業化的dPCR平臺也在不斷面世。國內一些科研單位和公司也進行了相關研發，致力于高端儀器國有化、低成本化[6]。通過把計算機技術運用在生命科學領域，能極大推動醫學發展，該軟件模型為用戶提供了友好的人機交互，功能模塊劃分明確；但是系統中仍然存在一些不足之處有待改進：

（1）實時定量PCR（qPCR）無法分辨2倍以下的基因表達差異或拷貝數變異，難以鑒定頻率低于1%的等位基因[7]。

（2）USB的串口通信不夠靈敏，建議改進驅動程序的算法。

【參考文獻】

[1]李春勇.數字PCR技術原理及應用[J].生物技術世界，2014（11）：10-13.

[2]何浩.基于DSP的實時PCR儀溫度控制系統的研制[D].北京：北京工業大學，2014.

[3]牟穎，金欽漢.一種大有前途的分析和診斷新技術：大規模集成流路（IFC）芯片-數字PCR[J].現代科學儀器，2010（1）：21-23.

[4]Dingle TC， Sedlak RH， Cook L， et al. Tolerance of droplet-digi-tal PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances[J].Clinical Chemistry，2013， 59（11）：1670-1672.

[5]羅磊.實時熒光PCR芯片系統設計及其生物學應用[D].武漢：華中科技大學，2010.

[6]王惠，錢沖，郭峰，關超，蘇長青，白洪志.實時定量PCR檢測技術研究進展[J]. seed，2013（6）：43-47.

[7]金欽漢.一種將改變人類“命”運的新技術[J].科學前沿，2010（07）：32-33.

[責任編輯：朱麗娜]