廣西新生兒遺傳性非綜合征型耳聾基因篩查

闕 婷，李 旺，耿國興，俸詩瀚，玉晉武，羅 超，林彩娟

(廣西壯族自治區婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，南寧 530012)

廣西新生兒遺傳性非綜合征型耳聾基因篩查

闕 婷，李 旺，耿國興，俸詩瀚，玉晉武，羅 超，林彩娟

(廣西壯族自治區婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，南寧 530012)

目的 應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術檢測廣西新生兒遺傳性非綜合征型耳聾(NSHI)基因突變基因，探討耳聾基因篩查在臨床中應用的有效性和可行性。方法 對7 100例出生的新生兒采用自動判別聽性腦干誘發電位(AABR)進行聽力初篩和復篩，并通過足跟血斑提取基因組DNA，采用MALDI-TOF-MS進行4個耳聾易感基因20個突變位點檢測。結果 7 100例新生兒聽力初篩通過率為97.11%(6 895/7 100)，新生兒基因突變陽性率為3.54%(251/7 100)，其中GJB2基因突變131例，攜帶率為1.84%，235delC雜合突變108例。SLC26A4基因突變93例，以1229C>T雜合突變和IVS7-2A>G雜合突變為主，mtDNA12SRNA基因突變16例，GJB3基因突變11例。結論 采用MALDI-TOF-MS技術篩查可提高常見耳聾相關基因熱點突變檢出率，從分子水平發現新生兒遺傳性NSHI，可為早期發現、預測耳聾的發生及制訂干預措施提供相應的遺傳咨詢指導。

新生兒篩查；非綜合征型耳聾；易感基因；飛行時間質譜

新生兒在出生期或出生時易因生理機能退化、感染、外傷、藥物使用不當及遺傳方面的病因情況導致耳聾。據報道大約60%的耳聾和遺傳因素有關[1]。先天性耳聾是引起言語交流障礙的常見疾病之一，有研究報道新生兒發病率約為1‰～3‰[2]。遺傳性耳聾分為非綜合征型耳聾(nonsyndromic hearing loss，NSHI)和綜合征型耳聾(syndromic hearing loss，SHI)，約70%為NSHI。流行病學調查表明中國耳聾人群常見致病突變有GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA、GJB3基因突變[3]。而常見的4個易感基因突變位點因不同地域、不同民族存在遺傳的差異性。近年來，關于遺傳性耳聾分子遺傳學研究報道有不少，基因芯片目前是臨床常用的檢測方法，但由于只針對常見的4個基因(GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體DNA 12SrRNA)9個突變位點，檢測位點限定、檢出率低、容易造成漏檢。廣西是一個少數民族群居的區域，因其所處的地域和民族差異，耳聾具有高度的異質性。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是廣泛應用新生兒篩查耳聾的技術手段，它具有通量高、成本低、位點覆蓋全面、時效期短、準確率高的優勢，同時結合臨床遺傳咨詢，可有效進行分子診斷研究。本研究采用MALDI-TOF-MS技術檢測大規模篩查方法，對7 100例新生兒進行4個耳聾易感基因20個突變位點檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年11月至2015年12月在廣西壯族自治區婦幼保健院出生的7 100例新生兒進行聽力篩查，其中男5 400例，女1 700例。本研究獲得醫院倫理委員會批準，家長均被詳細講解和告知聽力和基因篩查的相關知識，并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 聽力篩查方法 新生兒聽力初篩和復篩采用畸變產物耳聲發射技術(DPOAE)、自動判別聽性腦干誘發電位(AABR)。初篩于出生后3～5 d進行，在新生兒雙側外耳道清理后進行，測試時f1、f2強度分別為65、55 dB HL，測試4個頻率(2～5 kHZ)，信噪比大于7 dB HL，以4個頻率中3個以上通過為篩查通過標準。若復篩未通過，生后3個月時進行聽力學評估和醫學診斷。

1.2.2 DNA提取 在知情同意的情況下，用濾紙采集卡采集受檢新生兒手指末梢循環血共5個血斑(約250 μL)，應用廈門致善試劑磁珠提取微量DNA，利用ND-2000-UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計(美國NanoDrop公司)對標本的基因組DNA的提取質量和濃度進行檢測，并將DNA濃度調節至10 ng/μL。DNA樣品的吸光度(A)比值A260 nm/A280 nm應為1.6～2.0，A260 nm/A280 nm需大于或等于2.0，濃度需大于或等于10 ng/μL。

1.2.3 主要儀器和試劑 德國Biometra擴增儀、美國Sequenom公司的Mass Array DNA質譜陣列基因分析系統、Mass Array微量點樣系統以及試劑盒。

1.2.4 篩查耳聾基因突變類型 該檢測方法是針對4個耳聾基因20個突變位點而設計的。含GJB2基因的35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT突變；GJB3基因的538C>T、547G>A突變；SLC26A4(PDS)基因的281C>T、589G>A、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G、IVS7-2A>G、IVS15+5G>A突變，以及含mtDNA12SRNA基因的1494C>T、1555A>G突變。

2 結 果

2.1 聽力篩查結果 7 100例新生兒中，6 895例通過聽力初篩，初篩通過率為97.11%；205例(2.89%)未通過初篩的新生兒均進行復篩，復篩24例(11.71%)未通過。

2.2 聾病易感基因致病突變位點的檢測結果 7 100例新生兒耳聾基因篩查中，檢出耳聾易感基因陽性251例，攜帶率3.54%，見表1。

表1 7 100例新生兒耳聾基因檢測各位點突變攜帶率

3 討 論

耳聾是嚴重影響人類健康和致殘的聽力疾病，而先天性聽力障礙是新生兒最常見的先天性缺陷[4]。有文獻報道，耳聲發射(OAE)和聽性腦干誘發電位(ABR)是最有效的聽力篩查方式，然而這種篩查仍然有假陽性和假陰性的存在，如新生兒自身原因(羊水殘積、中耳功能喪失)、周邊環境影響及技術人員業務水平和儀器設備[5-6]。為避免出現的假陽性所給予家長造成的困擾，應施行多級聯合篩查，采用篩查耳聾易感基因，分析基因突變位點的差異性，結合遺傳咨詢并進行有效干預。

耳聾具有遺傳異質性，多種不同表型與突變基因的基因型有關，且隨著環境因素影響其易感性越強[7]。如病毒感染，早產、腦外傷、圍產期前后感染等因素都有可能導致耳聾疾病的發生。國內進行的耳聾病分子流行病學調查顯示，在新生兒中發病率約為1/1 000，約50%的耳聾患者有遺傳背景[8]。有研究發現，21%的耳聾患者帶有GJB2基因突變、14.5%的患者帶有SLC26A4基因突變、3.8%和0.6%的患者分別帶有線粒體DNAA1555G和GJB3突變。這一調查結果確定GJB2、SLC26A4、線粒體基因、GJB3是導致中國大部分遺傳性耳聾發生的最常見的4個基因[9-10]。研究表明上述基因突變所致的NSHI在不同種族、不同地域存在很大的差異，包括不同的突變形式和突變頻率，有很強的種族特異性[11]。

GJB2基因編碼縫隙連接蛋白26(CX26)對耳蝸滲透壓和聽覺起著重要的作用。GJB2基因突變影響循環通路和細胞信號傳導，從而導致感音神經性耳聾的發生。有文獻報道，中國耳聾人群中13.0%～26.7%由GJB2突變導致，235delC是GJB2最常見的突變[12]。本研究中GJB2基因是本地區NSHI相關基因的主要基因，235delC等位基因的頻率明顯高于其他幾個突變位點，表明235delC是該地區耳聾患者的熱點突變，這與文獻報道235delC為東亞地區主要突變一致[13]。

SLC234A4基因也是導致神經性聽力損失的主要責任基因，維持內耳淋巴液的離子轉運與平衡，可導致大前庭水管綜合征和Pendred綜合征[14]。是兒童常見的內耳畸形疾病之一，臨床表型常為遲發性和漸進性聽力損失，疾病加重與感冒、頭部外傷引起顱內壓升高相關[15]。本研究IVS7-2A>G和1229C>T 2個突變位點為主要的突變位點，而日本和韓國2168A>G為SLC26A4最主要突變[16-17]。因此，在不同地區和種族中，SLC26A4突變可能是導致神經性聽力損失的主要責任基因，但突變位點可能不同。

mtDNA12SRNA具有母系遺傳、自我復制、轉錄和編碼功能，可獨立于細胞核染色體以外的基因團中[18]。因mtDNA A1555G突變引起感音神經性耳聾臨床表型具有多樣性，推測可能原因為：由于線粒體DNA空間結構變化暴露氨基糖苷類藥物的結合位點，以致對耳蝸毛細胞的生物化學和生理功能產生干擾，引起內耳細胞的可逆和不可逆性損傷[19]。本研究1555A>G突變率較低，與Dai等[13]報道的突變率相一致。建議對這種臨床表型的患者家屬進行有效的防聾宣教，預警禁用氨基糖苷類抗菌藥物。

GJB3為夏家輝院士發現的NSHI相關基因，同時還在高危人群的聽力下降與基因的錯義突變和無義突變有關。本研究檢出6例538C>T雜合，突變率0.08%，突變頻率較小。其聽力篩查結果正常，需要定期隨訪。

本研究參照曾云等[20]方法，應用MALDI-TOF MS技術篩查新生兒NSHI基因的優點：(1)檢測位點數目高、覆蓋全，包含了中國人群中高發位點；(2)通量高、時效短，一次檢測只需10 s，一臺儀器每天通量3 000例；(3)MALDI-TOF MS的檢測結果與直接測序結果完全一致，檢測數據自動分析，具有高度靈敏性和準確性；(4)適用于大規模篩查，擴增試劑及儀器平均成本較低；(5)進行區域熱點突變的檢測，可個性化增加新的位點檢測需求。存在局限：對臨床已明確的遺傳性耳聾進行大規模篩查，MALDI-TOF MS暫時無法實現對未知突變基因、罕見基因、新基因的檢測。

總之，MALDI-TOF MS技術既能滿足臨床醫生對耳聾基因的檢測，又可以針對不同地區和民族的熱點突變譜及發生頻率進行個體化篩查，有效彌補傳統新生兒聽力篩查不足和提高遺傳性耳聾基因攜帶及遲發性和藥物性耳聾基因攜帶患兒的檢出。為實現早發現、早診斷、早干預的臨床措施提供遺傳咨詢指導，以減少耳殘疾的發生。

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Gene screening of neonatal non-syndromic hereditary hearing loss in Guangxi

QueTing,LiWang,GengGuoxing,FengShihan,YuJinwu,LuoChao,LinCaijuan

(GeneticMetabolicCentralLaboratory,MaternalandChildHeathCareHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning,Guangxi530012,China)

Objective To use the matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) technique for detecting the mutation gene of neonatal non-syndromic hereditary hearing impairment gene in Guangxi and to investigate its effectiveness and feasibility in clinical application.Methods A total of 7 100 newborns were performed the hearing preliminary screening and secondary screening by adopting AABR.The genomic DNA was extracted by the heel blood spot.Twenty mutation characteristics of 4 deaf predisposing genes were detected by MALDI-TOF-MS.Results The pass rate of hearing screening in 7 100 newborns was 97.11% (6 895/7 100),the positive rate of neonatal gene mutation was 3.54% (251/7 100),in which the GJB2 gene mutation was in 131 cases,the carrying rate was 1.84%,235delC heterozygous mutation was in 108 cases.SLC26A4 gene mutation was in 93 cases,which dominated by 1229C>T heterozygous mutation and IVS7-2A>G heterozygous mutation,mtDNA12SRNA gene mutation was in 16 cases and GJB3 gene mutation was in 11 cases.Conclusion Adopting the MALDI-TOF-MS screening technique can increase the detection rate of hot point mutation in common deaf related genes and discover neonatal genetic NSHI from molecular level and provides the corresponding genetic consulting guidance for early finding and predicting deaf occurrence,and formulating the interventional measures.

neonatal screening;nonsyndromic hearing loss;susceptibility gene;time of flight mass spectrometry

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.019

闕婷(1985-)，研究員，本科，主要從事產前診斷與優生優育研究。

R446.9

A

1671-8348(2017)07-0926-03

2016-07-25

2016-11-23)