GLP-1R和CK17在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義

曾 曦，陳 嘉，田 奕

(1.貴州醫科大學附屬醫院核醫學科，貴陽 550001；2.貴州醫科大學安順醫院核醫學科，貴州安順 561000)

GLP-1R和CK17在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義

曾 曦1，陳 嘉2，田 奕2

(1.貴州醫科大學附屬醫院核醫學科，貴陽 550001；2.貴州醫科大學安順醫院核醫學科，貴州安順 561000)

目的 探討甲狀腺乳頭狀癌組織中胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)和細胞角蛋白17(CK17)的表達及臨床病理意義。方法 采取免疫組織化學及免疫印跡法檢測甲狀腺正常組織(對照組，n=50)和甲狀腺乳頭狀癌組織(觀察組，n=80)中GLP-1R和CK17的表達，并分析二者水平與甲狀腺乳頭狀癌病理因素間的相關性。結果 對照組中22例(44.00%)有GLP-1R蛋白低表達；觀察組中77例(96.25%)有GLP-1R蛋白表達，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。對照組中有8例(16.00%)CK17表達陽性；觀察組中CK17陽性表達有77例(96.25%)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。GLP-1R的陽性表達與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理因素間差異無統計學意義(P>0.05)。CK17表達與甲狀腺乳頭狀癌患者的性別、年齡無明顯相關(P>0.05)，而與腫瘤的直徑、臨床分期及頸部淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)。結論 甲狀腺乳頭狀癌組織中GLP-1R和CK17均高表達， CK17表達與甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤直徑、臨床分期及頸部淋巴結轉移明顯相關。

甲狀腺腫瘤；胰高血糖素樣肽-1受體；細胞角蛋白17；免疫組織化學；免疫印跡法

甲狀腺乳頭狀癌為甲狀腺惡性腫瘤中最常見類型，據統計甲狀腺乳頭狀癌約占整個甲狀腺惡性腫瘤的80%[1]，近年甲狀腺癌的患病率在世界范圍內呈逐漸增加趨勢，有文獻報道甲狀腺乳頭狀癌約占全身惡性腫瘤的1.00%～4.42%，已成為常見惡性腫瘤之一[2]。經淋巴轉移是甲狀腺乳頭狀癌的常見臨床特點之一，約50%的患者在手術時常合并有淋巴結浸潤[3-4]。目前，甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理診斷以細胞核形態為主要特征，如核溝、毛玻璃樣核及核內包涵體等；然而，臨床實踐中部分甲狀腺良性病變，如結節性甲狀腺腫、橋本氏甲狀腺炎及濾泡性腺瘤等也常合并毛玻璃樣核等病理改變，故給甲狀腺乳頭狀癌的確診產生難度[1]。本研究應用免疫組織化學和免疫印跡法檢測胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon-like peptide-1 receptors，GLP1R)和細胞角蛋白17(cytokeratin17，CK17)在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達，分析二者陽性水平與甲狀腺乳頭狀癌的病理因素間的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取貴州醫科大學附屬醫院2013年3月至2015年9月收集的100例甲狀腺乳頭狀癌患者病理標本100份(觀察組)，其中男16例，女84例；年齡39～61歲，平均(50.58±7.61)歲。將100份標本分為2部分，其中80份用于免疫組織化學和臨床研究，男12例，女68例；年齡39～60歲，平均(50.26±7.78)歲。所有病例均為首次手術，術前均未接受任何化學治療和放射治療，參照WHO腫瘤學分類[5]標準均為甲狀腺乳頭狀癌，臨床資料完整。TNM分期參照2002年國際抗癌聯盟(UICC)制定的標準進行[6]，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期43例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例；腫瘤直徑：>1 cm者51例，≤1 cm者29例；經病理檢查合并頸部轉移34例，無頸部轉移46例。20份標本用于免疫印跡檢測。另選擇經病理檢查證實為正常甲狀腺組織60例為對照組，男10例，女50例；年齡40～62歲，平均(50.03±7.45)歲。其中50例用于免疫組織化學測定，男6例，女44例；年齡40～60歲，平均(49.96±7.97)歲。10例用于免疫印跡檢測。兩組對象基本臨床情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有標本組織的獲得均簽署書面協議，且研究經貴州醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 正常山羊血清(美國Vector laboratories公司，貨號S-1000)；GLP-1R兔多克隆抗體(英國Santa Cruz公司，貨號ab188605)；CK17兔單克隆抗體(英國Santa Cruz公司，貨號ab109725)；生物素標記的山羊抗兔IgG(美國Vector laboratories，貨號BA-1000)；親和素-生物素-酶復合物(ABC)復合物(美國Vector laboratories，貨號PK-4000)；二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(美國Vector laboratories，貨號SK-4100)；兔抗β-Actin多克隆抗體(北京普利萊基因技術有限公司，貨號C1845)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號A0208)。

1.2.2 免疫組織化學染色 (1)組織處理：將全部標本放入4%多聚甲醛中固定96 h，梯度蔗糖溶液逐級脫水，聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物(OCT)包埋，行冰凍切片，每份標本2套組織切片，收入緩沖液中。(2)染色：切片分別行封閉液(30%H2O2和正常山羊血清和Triton-X-100)室溫處理30 min，一抗兔抗GLP-1R(1∶3 000)和兔抗CK17(1∶1 000)4 ℃孵育24 h，二抗生物素標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫孵育2 h，ABC復合物室溫孵育2 h，DAB顯色，緩沖液漂洗，裱片，蔗糖逐級脫水，二甲苯透明及中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察并拍照。(3)結果判定：參照文獻[7]的方法，GLP-1R和CK17陽性反應為細胞質內呈現棕黃色顆粒，由2名經驗豐富的病理醫師采用雙盲法閱片，在光學顯微鏡下任取5個視野。①按染色強度評分，0分為不著色，1分為淺棕黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；②按陽性細胞數評分，<5%為0分，5%～<26%為1分，26%～<51%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。綜合①②判斷結果：陰性0～1分；弱陽性2～4分；陽性5～8分；強陽性9～12分。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測 無菌條件下取甲狀腺乳頭狀癌組織，裂解液處理后，BCA行蛋白定量，取蛋白上樣行蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉膜、封閉，分別用一抗兔抗GLP-1R(1∶20 000)和兔抗CK17(1∶15 000)孵育過夜，二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)處理，化學發光液處理，顯影和定影；應用β-actin為內參，運用NIH Image圖像分析軟件分析GLP-1R和CK17蛋白的平均吸光度值(average absorbance，AA)，與內參照吸光度值比較后再行結果統計分析。

2 結 果

2.1 兩組對象甲狀腺組織中GLP-1R陽性表達比較 GLP-1R的陽性反應在正常甲狀腺組織中基本缺失(圖1A)，在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈散在分布，為粗細不等的棕黃色顆粒(圖1B、C、D)。對照組中GLP1R蛋白低表達，陽性率為44.00%(22/50)；觀察組中GLP1R蛋白表達陽性率為96.25%(77/80)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 兩組對象甲狀腺組織中CK17表達水平比較 CK17在對照組呈陰性反應(圖2A)，而在觀察組其陽性反應在細胞質中表達(圖2B、C、D)；對照組中CK17表達陽性率為16.00%(8/50)；觀察組中CK17陽性表達率為96.25%(77/80)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

A：對照組陰性表達；B：觀察組弱陽性表達；C：觀察組陽性表達；D：觀察組強陽性表達。

圖1 GLP-1R在兩組對象甲狀腺組織中的表達(×100)

A：對照組陰性表達；B：觀察組弱陽性表達；C：觀察組陽性表達；D：觀察組強陽性表達。

圖2 CK17在兩組對象甲狀腺組織中的表達(×100)

2.3 GLP-1R和CK17蛋白免疫印跡結果分析 免疫印跡結果表明，GLP-1R和CK17蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達明顯增多(圖3)，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

圖3 兩組對象甲狀腺組織中GLP-1R 和CK17的表達

組別nGLP1RCK17對照組100.431±0.060.215±0.03觀察組200.703±0.09a0.722±0.09a

a：P<0.01，與對照組比較。

2.4 GLP-1R和CK17陽性表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素的關系 GLP-1R與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理因素間差異無統計學意義(P>0.05)；CK17與甲狀腺乳頭狀癌患者的性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，與腫瘤的直徑、臨床分期及頸部淋巴結轉移相關(P<0.05)，見表2。

表2 GLP-1R 和CK17陽性表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素的關系(n=80)

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌是發病率增長較快的惡性腫瘤之一，依據WHO腫瘤學分類標準：甲狀腺乳頭狀癌屬甲狀腺惡性上皮腫瘤，具有明顯的濾泡細胞分化、特征性胞核改變，乳頭及濾泡結構可界定為典型[8]。然而，在臨床病理診斷和研究中常有不典型病例存在，此外乳頭狀甲狀腺癌的一些病理特征，如頸部淋巴結轉移等在患者初始治療時，采取術前超聲、術中觸診等均未能確診隱性頸部淋巴結的轉移狀態[9]。因此，本研究應用免疫組織化學和免疫印跡法對甲狀腺乳頭狀癌進行輔助診斷。

GLP-1R是胰高血糖素受體亞家族，屬G蛋白偶聯受體B家族，可介導GLP1發揮生物學作用[10]。GLP-1R不僅表達于胰腺，也表達于胰腺外組織，包括中樞神經系統、心血管、胃腸道、腎臟等[11]。GLP-1R被激活后，G蛋白β和γ亞基經磷脂酰肌醇-3-激酶及絲裂原活化蛋白激酶信號途徑對β細胞的增殖和分化起到誘導效果[12-13]。近年研究發現，GLP-1R在甲狀腺乳頭狀癌細胞也呈大量分布，文獻報道嚙齒類動物使用艾塞那肽(GLP-1R激動劑)可誘發甲狀腺C 細胞的增生及甲狀腺癌的發生[14-15]。提示GLP-1R可能是甲狀腺乳頭狀癌的一種新指標蛋白，但GLP-1R在人甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及其與其病理因素的相關性尚鮮見報道。

本研究應用免疫組織化學法檢測GLP-1R的陽性表達結果提示，GLP-1R在正常甲狀腺組織中陽性反應基本缺失，在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈散在分布；50例正常甲狀腺組織中22例(44.00%)有GLP-1R蛋白低表達；80例甲狀腺乳頭狀癌組織中77例(96.25%)有GLP1R蛋白表達，二者比較差異有統計學意義(P<0.01)。免疫印跡結果表明：GLP1R在甲狀腺乳頭狀癌組織中的水平明顯高于對照組(P<0.01)。進一步分析發現，GLP-1R與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理因素無明顯相關。有研究發現，人甲狀腺乳頭狀癌細胞中存在大量GLP-1R表達，但GLP-1R激動劑對甲狀腺癌細胞的增殖無顯著促進作用[16-17]。因此，本研究通過不同檢測方法進一步證實了上述結果。

CK17是一種細胞骨架蛋白，在人位于染色體17q12-q21，轉錄長度為1 299 bp，相對分子質量為48.1×103，在正常組織CK17表達于復層上皮細胞，腫瘤組織中則位于腺癌及鱗狀細胞癌[18-19]。文獻報道稱CK17在乳頭狀癌組織中呈局灶性表達，且分化好的乳頭狀癌未見陽性表達，而CK17的表達與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移呈正相關[20-21]。本研究采取免疫組織化學染色發現，CK17在正常喉組織呈陰性反應，在甲狀腺乳頭狀癌組織CK17的陽性反應主要位于細胞質；50例正常甲狀腺組織中有8例CK17表達陽性(占16.00%)，80例甲狀腺乳頭狀癌組織中CK17陽性表達有77例(占96.25%)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。免疫印跡檢測發現：CK17蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達明顯增多，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。進一步分析發現，CK17與甲狀腺乳頭狀癌患者的性別、年齡間無顯著性差異，與腫瘤的直徑、臨床分期及頸部淋巴結轉移間有顯著性相關。與上述文獻報道一致，提示CK17與甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展存在密切相關，可能作為臨床鑒別診斷該腫瘤的分子學標志物。

綜上所述，GLP1R和CK17在甲狀腺乳頭狀癌組織中均呈高表達，GLP1R的高表達與甲狀腺乳頭狀癌的病理因素間無顯著性相關，CK17的高表達與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理因素間呈正相關。由于本研究為小樣本試驗及免疫組化方法存在假陽性結果等情況，上述結果仍需大樣本進一步驗證。

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Expressions of GLP-1R and CK17 in papillary thyroid cancer and clinical significance

ZengXi1,ChenJia2,TianYi2

(1.DepartmentofNuclearMedicine,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China; 2.DepartmentofNuclearMedicine,AnshunHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Anshun,Guizhou561000,China)

Objective To investigate the expressions of glucagon-like peptide-1 receptors(GLP-1R) and cytokeratin17 (CK17) in papillary thyroid cancer tissue and clinicopathological significance.Methods The immunohistochemistry and immunoblotting method were employed to detect the expressions of GLP-1R and CK17 in normal thyroid tissues (control group,50 cases) and papillary thyroid cancer tissue (observation group,80 cases).Then the correlation between the expressions of GLP-1R and CK17 with pathological factors of thyroid cancer was analyzed.Results Low expression of GLP-1R was found in 22 cases(44.00%) of the control group,while GLP-1R was expressed in 77 cases(96.25%) of the observation group,and the difference between both groups was statistically significant(P<0.01).The expression of CK17 was positive in 8 cases(16.00%) of the control group,while 77 cases(96.25%) in the observation group were CK17 expression positive,and the difference between both groups was statistically significant(P<0.01).The difference between GLP-1 positive expression and clinicopathologic factors had no statistical significance(P>0.05).The difference between CK17 expression with sex and age had no statistical significance (P>0.05),and was obviously related with the tumor diameter,clinical stages and cervical node metastasis of thyroid neoplasms(P<0.05).Conclusion GLP-1R and CK17 all are highly expressed in papillary thyroid cancer tissue and CK17 expression is obviously related with the tumor diameter,clinical stages and cervical node metastasis of papillary thyroid cancer.

thyroid neoplasms;glucagon-like peptide-1 receptors;cytokeratin 17;immunohistochemistry;immunoblotting

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.017

曾曦(1973-)，副教授，碩士研究生，主要從事甲狀腺疾病的診治研究。

R739.91

A

1671-8348(2017)07-0919-04

2016-09-03

2016-11-21)