血清miRNA-210和miRNA-21聯合檢測對NSCLC的臨床應用價值

周金林，鄧述愷

(1.西南醫科大學研究生院臨床醫學系，四川瀘州 646000;2.四川省巴中市中心醫院呼吸內科 636000)

血清miRNA-210和miRNA-21聯合檢測對NSCLC的臨床應用價值

周金林1,2，鄧述愷1△

(1.西南醫科大學研究生院臨床醫學系，四川瀘州 646000;2.四川省巴中市中心醫院呼吸內科 636000)

目的 探討血清miRNA-210和miRNA-21聯合檢測對非小細胞肺癌(NSCLC)的臨床應用價值。方法 選擇四川省巴中市中心醫院確診的NSCLC患者48例(NSCLC組)，另選擇肺良性病變患者40例、健康體檢者40例作為對照研究，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血清miRNA-210和miRNA-21水平。結果 NSCLC患者血清miRNA-210和miRNA-21水平明顯高于肺良性病變和健康體檢者(P<0.05)；血清miRNA-210在腺癌、T3～4期患者高表達(P<0.05)，miRNA-21在腺癌、T3～4期、吸煙患者高表達(P<0.05)；血清miRNA-210、miRNA-21診斷NSCLC的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分別為0.845、0.725，二者聯合AUC為0.928(P=0.021)；COX多因素回歸分析顯示，血清miRNA-210(RR：1.977，95%CI：0.985～3.018，P=0.009)和miRNA-21(RR：1.853，95%CI：0.921～2.776，P=0.018)對NSCLC患者預后有一定預測價值。結論 miRNA-210和miRNA-21在NSCLC患者血清高表達，二者聯合檢測可能對NSCLC有一定診斷效能，并對預后有一定提示作用。

癌，非小細胞肺；微RNA；血清

肺癌是常見惡性腫瘤，其發病率和病死率在世界范圍內呈逐年增加的趨勢，已成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。肺癌按照病理分型可分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，而NSCLC占肺癌總發病的80%左右[1]。NSCLC發病隱匿、早期癥狀不明顯，多數患者發現時已經進展至中、晚期，加之病情復雜、進展快，雖然近年來的治療手段越來越多樣化，但是其5年生存率并不理想，僅有15%～20%[2]。提高NSCLC的診斷效率對治療、預后有積極意義[1-3]。常用診斷NSCLC的方法有影像學、細胞學、腫瘤標志物檢查等，病理活檢是肺癌診斷的金標準，但是通過纖支鏡或胸壁針取得組織標本是一個有創過程，容易引起組織損傷或癌細胞沿穿刺針道擴散，一般只在高度懷疑的情況下做確診使用[4]。目前提倡對腫瘤患者通過高效、無創的檢查手段進行診斷和預后判斷，微RNA(microRNA，miRNA)血清學檢測正是這樣一種經濟、簡單、有效的診斷方法。惡性腫瘤的發生、進展被認為與miRNA表達失衡有關[5]，最初的研究認為miRNA僅在腫瘤組織異常表達，發揮促癌或抑癌作用，但是隨著研究的深入，發現miRNA失衡表達在外周循環血也有體現，并且可以此作為腫瘤診斷的生物標志物[6]。本研究對48例NSCLC患者進行血清miRNA-210和miRNA-21水平檢測，分析其與NSCLC發病的關系、診斷價值和預后判斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇四川省巴中市中心醫院呼吸內科2012年1月至2014年1月確診的NSCLC患者48例(NSCLC組)，其中男28例，女20例；年齡37～69歲，中位56歲；參考WHO制定的細胞分類法：腺癌33例，鱗癌15例；臨床分期：T1～2期30例，T3～4期18例。納入標準：(1)所有病例均經病理學診斷確診為NSCLC；(2)具備完整的臨床診斷、治療資料；(3)取得待測標本前患者均未經過放療、化療及生物制劑等治療。排除標準：(1)患者出現呼吸困難等可能導致體內缺氧的癥狀；(2)患者患嚴重心、肝、腎及代謝性疾病，或出現嚴重惡病質。另選擇肺良性病變患者40例(良性病變組)，其中男25例，女15例；年齡40～72歲，中位58歲；肺大皰者18例，結核瘤12例，炎性假瘤10例。健康體檢者40例(對照組)，其中男25例，女15例；年齡35～68歲，中位56歲。3組對象在性別、年齡等比較中差異無統計學意義(P>0.05)。本研究通過醫院倫理委員會審批，所有患者均知曉本研究目的、過程和意義，并同意參與，簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 ABI-7300熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)、血清RNA提取試劑盒(Applied Biosyste公司，美國)、熒光定量PCR試劑盒(北京艾德萊生物)、引物設計與合成(上海生工)。

1.2.2 標本采集 采集NSCLC患者入院第2天、未行任何放療、化療及生物制劑等治療前，以及肺良性病變患者、健康體檢者，清晨空腹靜脈血5 mL，室溫靜置15～30 min，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取血清于潔凈1.5 mL離心管，-80 ℃冰箱保存待測。

1.2.3 cDNA合成 嚴格按照血清RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，分光光度儀檢測260/280吸光度，1.8～2.2為合格標本，可進行下一步逆轉錄。逆轉錄反應體系：1 μg RNA，5×RT緩沖液5 μL，10 mmol/L dNTP 0.75 μL，40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL，200 U/μL逆轉錄酶0.2 μL，其余以去離子水補足至20 μL。PCR儀設置逆轉錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，待轉錄結束后置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測 以定量熒光PCR儀使用miRNA Real-time PCR實時熒光定量反應試劑盒進行擴增反應，以U6為內參檢測目的基因相對表達水平，U6、miRNA-210、miRNA-21引物序列見表1。反應體系：cDNA產物1.0 μL，2×miRNA qPCR Mix10 μL，Forward primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，余用雙蒸水(ddH2O)水補齊至20 μL。擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s，共40個循環，所有反應設立3個復孔。根據各樣品RT-qPCR曲線得到Ct值，Ct值表示熒光達到閾值所需要的循環數。血清miRNA水平采用相對表達量2-△Ct描述，△Ct=Ct miRNA-Ct U6，表示目的基因相對于內參基因表達水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件統計包進行統計學分析，正態性分布檢驗顯示miRNA水平2-△Ct呈非正態分布，所以采用中位數及四分位數(25%分位數～75%分位數)描述。NSCLC患者、肺良性病變患者、健康體檢者組間血清miRNA水平采用Wilcoxon符號秩和檢驗；NSCLC患者病理特征與血清miRNA水平的關系采用MannWhitneyU檢驗；血清miRNA對NSCLC診斷效能采用受試者工作特征(ROC)曲線分析；采用Kaplan-Meier法分析患者疾病無進展生存時間(PFS)；采用COX比例風險回歸模型進行多因素生存分析；均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同組間血清miRNA表達水平比較 NSCLC組患者血清miRNA-210相對表達水平為1.68(0.92～1.94)，良性病變組患者相對表達水平為0.93(0.38～1.31)，對照組相對表達水平為1.02(0.40～1.29)，NSCLC組患者表達水平明顯升高(P<0.05)，良性病變組與對照組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。在血清miRNA-21相對表達水平比較中，NSCLC組患者為9.23(5.17～14.02)，良性病變組患者為4.17(1.39～7.21)，對照組為3.83(1.22～6.88)，NSCLC組患者表達水平明顯高于良性病變和對照組(P<0.01)，而良性病變與對照組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

表1 引物序列

圖1 3組對象血清miRNA-210、miRNA-21水平比較

2.2 NSCLC患者臨床特征與血清miRNA水平的關系 血清miRNA-210在腺癌、T3～4期高表達(P<0.05)，而與年齡、性別及是否吸煙無明顯關系(P>0.05)；血清miRNA-21在腺癌、T3～4期、吸煙患者高表達(P<0.05)，而與年齡、性別無明顯關系(P>0.05)，見表2。

表2 不同臨床特征NSCLS患者血清miRNA水平比較

續表2 不同臨床特征NSCLS患者血清miRNA水平比較

圖2 miRNA對NSCLC診斷的ROC曲線分析

圖3 PFS生存曲線分析

2.3 miRNA聯合檢測對NSCLC的診斷效能 通過ROC曲線分析顯示，血清miRNA-210的曲線下面積(AUC)為0.845，敏感性為74.10%，特異性為78.20%；miRNA-21的AUC為0.725，敏感性為69.70%，特異性為77.60%；而miRNA-210、miRNA-21聯合檢測AUC為0.928，敏感性為82.40%，特異性為80.50%。提示血清miRNA-210和miRNA-21對NSCLC均有一定診斷效能，而二者聯合檢測對NSCLC診斷效能更佳(P=0.021)，見圖2。

2.4 PFS生存曲線分析 根據ROC曲線最大約登指數得出血清miRNA-210最佳診斷臨界值2-△Ct為1.60，miRNA-21最佳診斷臨界值2-△Ct為10.01，以此分為高表達組與低表達組。結果顯示miRNA-210 高表達患者中位PFS為9.20月，低表達患者中位PFS為14.80月，兩組比較差異有統計學意義(P=0.031)；miRNA-21高表達患者中位PFS為10.00月，低表達患者中位PFS為15.30月，兩組比較差異有統計學意義(P=0.028)，見圖3。

2.5 患者預后因素分析 對患者PFS進行COX多因素回歸分析，結果顯示血清miRNA-210和miRNA-21表達、組織類型、T分期均與患者中位PFS顯著相關，血清miRNA-210(RR：1.977，95%CI：0.985～3.018，P=0.009)和miRNA-21(RR：1.853，95%CI：0.921～2.776，P=0.018)可能是NSCLC患者預后的獨立危險因素，見表3。

表3 NSCLC患者預后多因素分析

3 討 論

miRNA是一類廣泛存在于真核細胞、進化保守、長度約為20～22個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，可以抑制RNA翻譯或者導致序列特異性靶mRNA降解，以調控分化、增殖、凋亡等細胞生物學行為[7]。研究顯示，占比不到人類基因組3%的miRNA卻參與了多達30%的基因調控，超過50%的miRNA位于惡性腫瘤相關基因調控區域內，體內miRNA失衡可能是腫瘤發生的重要機制之一[5]。NSCLC發病機制復雜，miRNA可能通過多種途徑影響其發生與進展，如miRNA-449a在NSCLC低表達[8]，可能發揮抑癌作用，miRNA-214在NSCLC高表達[9]，可能扮演促癌的角色，而miRNA-125b可能與NSCLC耐鉑類藥物化療相關[10]。外周循環血存在大量miRNAs，其穩定性高、輕易不被降解，多數來自循環腫瘤細胞或腫瘤組織，常常提示相關基因的異常表達，對腫瘤早期診斷、分期、預后有一定預見作用。Chen 等[11]通過RT-PCR對400 例 NSCLC患者和220例健康對照者血清miRNA水平檢測，在2個階段的選擇、驗證分析后，證實miRNA-20a、miRNA-24、miNA-25等10個miRNA與健康對照者存在顯著差異性表達。表明血清miRNA檢測可以作為NSCLC無創診斷的潛在生物標志物。

本研究選擇miRNA-210和miRNA-21作為NSCLC診斷的目標miRNA，既往研究多以肺癌組織兩種miRNA表達失衡為研究切入點，而兩種miRNA在NSCLC患者血清學水平聯合檢測的價值則鮮見報道。miRNA-210受缺氧誘導因子1(HIF-1)調節，在細胞對缺氧的應答過程中發揮重要作用，如血管生成、細胞周期調節、DNA修復等，在腫瘤發生、發展過程中具有多面性，既可以表現為促癌作用，也可以抑制腫瘤進展[12]。Osugi等[13]對80例通過外科手術治療的NSCLC患者miRNA-210表達進行分析，證實miRNA-210在腫瘤組織高表達，并且和淋巴結轉移、臨床分期等相關，在腺癌組織過表達尤其顯著，提示miRNA-210可能在NSCLC發病過程起到促癌基因作用。miRNA-21失衡表達也與NSCLC發病關系密切，Xie等[14]從NSCLC患者痰液中提取miRNA-21進行定量分析，發現miRNA-21表達明顯升高。Wang等[15]通過實驗發現，在沉默miRNA-21后可以阻斷肺癌A549細胞周期進程，降低細胞增殖能力，表明miRNA-21可能與肺癌進展相關；其團隊對NSCLC腫瘤組織檢測后證實，miRNA-21顯著高表達，并且與淋巴結轉移、不良狀態和危險預后呈正相關。本研究結果顯示，NSCLC組患者血清miRNA-210和miRNA-21水平明顯高于良性病變組和對照組(P<0.05)，而良性病變組和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示miRNA-210和miRNA-21可能作為促癌基因在NSCLC發揮作用，其血清水平過表達可能是NSCLC診斷的潛在生物標志物。進一步分析發現，NSCLC患者miRNA-210和miRNA-21血清水平與臨床病例特征相關：血清miRNA-210在腺癌、T3～4期患者表達明顯升高(P<0.05)，而miRNA-21則在腺癌、T3～4期、吸煙患者呈高表達狀態(P<0.05)。以上結果表明，miRNA-210、miRNA-21不但參與NSCLC發病，并且可能還與腫瘤細胞轉移、侵襲等有一定關系，對臨床分期、組織分型有一定提示作用[13,15]。

本研究將miRNA-210和miRNA-21血清水平作為NSCLC診斷標志物，通過ROC曲線分析其診斷效能，結果顯示miRNA-210、miRNA-21可能對NSCLC有一定診斷價值，而二者聯合應用可能有更佳的診斷效能。Zhao等[16]的研究顯示，血清miRNA-21診斷NSCLC的AUC為0.812，敏感性73.8%，特異性71.1%。Zhu等[17]對112例NSCLC患者多種miRNA血清水平診斷價值進行研究，發現miRNA-210對NSCLC患者早期有較好的診斷價值，尤其聯合miRNA-182、 miRNA-183、miRNA-126檢測時AUC可以達到0.965，敏感性為81.3%，特異性為100%，其診斷價值明顯高于癌胚抗原(CEA)。本研究結果與其類似，也提示單獨一種miRNA用于診斷NSCLC能力有限，而多種miRNA聯合檢測則可以明顯提升診斷效率。

miRNA具有調控細胞生物學行為的能力，其失衡表達可以通過對細胞行為的改變而表現出機體不適應性。對惡性腫瘤而言，miRNA失衡表達可能會影響患者預后。Wang等[18]對16篇報道文獻的7種不同惡性腫瘤miRNA-210表達與預后關系進行Meta分析，發現miRNA-210高表達對乳腺癌、膀胱癌等生存時間有明顯負性影響。miRNA-21在食管鱗狀細胞癌患者高表達被認為與PFS、總生存時間縮短有明顯關系[19]。既往研究認為miRNA-210和miRNA-21可能與Ⅰ期NSCLC復發相關[20]。Donnem等[21]從335例NSCLC石蠟埋樣標本選取10例長生存期和10例短生存期標本做miRNA分析，發現miRNA-210和miRNA-21在短生存期患者明顯高表達，這可能與二者是腫瘤血管生成miRNA有關。本研究以ROC曲線得出臨界值，證實miRNA-210、miRNA-21血清高表達患者中位PFS均顯著低于低表達患者(P<0.05)，顯示miRNA-210、miRNA-21與疾病進展可能存在一定關系。對PFS進行COX多因素回歸分析發現，血清miRNA-210(RR：1.977，95%CI：0.985～3.018，P=0.009)和miRNA-21(RR：1.853，95%CI：0.921～2.776，P=0.018)均是預測NSCLC患者PFS的獨立危險因素。進一步證實miRNA-210、miRNA-21可能與疾病進展有關，可能是NSCLC患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，NSCLC患者血清miRNA-210和miRNA-21水平呈高表達狀態，與臨床特征有一定關系，二者聯合檢測可能對NSCLC的診斷有一定價值。miRNA-210、miRNA-21可能是NSCLC患者預后的獨立危險因素。本研究存在標本量小、無基礎機制研究等缺陷，結果存在一定局限性，但是對血清miRNA用于NSCLC診斷、治療和預后評估具有積極的探索意義，而血清miRNA檢測用于NSCLC診斷還需要大樣本量的數據支持，有待進一步深入研究和探討。

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Clinical application value of combined detection of serum miRNA-210 and miRNA-21 in non small cell lung cancer

ZhouJinlin1,2,DengShukai1△

(1.FacultyofClinicalMedicine,GraduateSchool,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.DepartmentofRespiration,BazhongMunicipalCentralHospital,Bazhong,Sichuan636000,China)

Objective To investigate the clinical value of combined detection of serum miRNA-210 and miRNA-21 in non small cell lung cancer (NSCLC).Methods Forty-eight patients with NSCLC in the Bazhong Municipal Central Hospital were selected as the research subjects.Forty patients with benign lung diseases and 40 individuals undergoing healthy physical examination were selected as the control groups.The levels of serum miRNA-210 and miRNA-21were detected by RT-qPCR.Results The levels of serum miRNA-210 and miRNA-21 in the patients with NSCLC were significantly higher than those in the patients with benign lung diseases and healthy controls(P<0.05);serum miRNA-210 was highly expressed in adenocarcinoma and T3-4stage patients(P<0.05) and miRNA-210 was highly expressed in adenocarcinoma,T3-4stage and smoking patients(P<0.05);the area under the ROC curve(AUC) of miRNA-210 and miRNA-21 for diagnosing NSCLC was 0.845 and 0.725 respectively,but AUC of their combination was 0.928(P=0.021);COX multivariate regression analysis showed that serum miRNA-210(RR：1.977，95%CI：0.985-3.018，P=0.009)and miRNA-21(RR：1.853，95%CI：0.921-2.776，P=0.018)had some predictive value for the prognosis in the patients with NSCLC.Conclusion MiRNA-210 and miRNA-21 are highly expressed in serum of the patients with NSCLC.Their combined detection can have a certain diagnostic efficiency for NSCLC and have a certain prompt action on the prognosis.

carcinoma,non-small-cell lung;microRNA;serum

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.014

周金林(1985-)，主治醫師，在讀碩士研究生，主要從事肺癌的發病機制和臨床治療研究。△

，E-mail:dsk_lan@163.com。

R734.2

A

1671-8348(2017)07-0908-05

2016-08-26

2016-11-11)