蛇床子素對宮頸癌Hela細胞凋亡的作用研究*

于有江，彭建明，葉記林，蘇蘭娣，羅 雪

(揚州職業大學醫學院，江蘇揚州 225009)

蛇床子素對宮頸癌Hela細胞凋亡的作用研究*

于有江，彭建明#，葉記林，蘇蘭娣，羅 雪

(揚州職業大學醫學院，江蘇揚州 225009)

目的 探討蛇床子素對人宮頸癌Hela細胞增殖、凋亡的作用及可能的機制。方法 經不同濃度蛇床子素處理體外培養的宮頸癌Hela細胞，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞內活性氧(ROS)水平，半定量RT-PCR法檢測Bcl-2和Bax mRNA 的表達。結果 與對照組比較，不同濃度的蛇床子素均可明顯抑制人宮頸癌Hela細胞增殖、誘導細胞凋亡，增高細胞內ROS水平，降低Bcl-2/Bax的表達比例，且具有一定的劑量依賴性。結論 蛇床子素抑制人宮頸癌Hela細胞增殖并促進細胞凋亡，與升高細胞ROS水平、促進激活促凋亡因子Bax的表達和抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達有關。

宮頸腫瘤；蛇床子素；細胞凋亡

蛇床子素(Osthole)是從中藥蛇床子中提取的一種香豆素，其化學名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，具有多種藥理學和生物化學活性[1-2]。現代研究表明，蛇床子素具有多種藥理學功能，不僅能保護肝臟、保護神經、抗骨質疏松、抗炎等，還有較強的抗癌活性[2-4]。目前為止關于蛇床子素在宮頸癌中的研究較少，本研究以人宮頸癌細胞Hela為模型，觀察蛇床子素抗宮頸癌的作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌Hela細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。蛇床子素購自上海詩丹德生物公司(純度98%)，用二甲基亞砜(DMSO)配成200 mmol/L 的貯存液；RPMI-1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為AMRESO產品；Annexin V-PI細胞凋亡和細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞接種于RPMI-1640培養液(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。取對數生長期細胞用于以下各實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖 取對數生長期細胞，調整細胞濃度為5×104個/ mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。24 h后按分組要求加入不同劑量的蛇床子素(20、40、80、120、160、200 μmol/L)，溶劑對照組加等體積的0.1%DMSO，同時設不加細胞只加培養液的孔為空白對照(對照組)。終止培養前4 h每孔加入10 μL MTT。培養4 h后，吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解反應產物，在酶標儀上檢測492 nm的吸光度值(OD)。抑制率計算如下：

抑制率=(1-OD藥物組/OD對照組)×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將各處理組(蛇床子素100、150、200 μmol/L)細胞用胰酶消化，離心收集細胞，PBS 洗滌2 次后用500 μL Binding buffer重懸細胞，并加入Annexin V和碘化丙啶(PI)輕輕混勻，室溫避光孵育15 min后，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 DCFH-DA法觀察細胞ROS水平 采用熒光探針DCFH-DA進行ROS檢測。取經蛇床子素處理48 h后的Hela細胞，胰酶消化后，用無血清培養基重懸，加入DCFH-DA溶液，37 ℃孵育30 min后利用流式細胞儀檢測細胞的ROS水平。

1.2.5 RT-PCR法檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達 取經蛇床子素處理48 h后的Hela細胞，用TRIzol 抽提細胞總RNA，逆轉錄為互補DNA(cDNA)，取適量cDNA為模板，PCR法檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參，進行組間差異比較。引物如下：Bcl-2上游引物為5′-GGT CGC CAG GAC CTC GCC GC-3′，下游引物為5′-AGT CGT CGC CGG CCT GGC G-3′；Bax上游引物為5′-GAG CTG CAG AGG ATG ATT GC-3′，下游引物為5′- AGC CCA ACA GCC GCT CCC GG-3′；GAPDH上游引物為5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′，下游引物為5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′。

2 結 果

2.1 各組腫瘤細胞增殖率比較 通過MTT法觀察不同濃度蛇床子素對宮頸癌Hela細胞增殖的影響，結果顯示，蛇床子素對宮頸癌Hela細胞的增殖具有明顯的抑制作用，蛇床子素各劑量組與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，而且隨藥物濃度的增加，其抑制作用逐漸增強，見圖1。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

圖1 蛇床子素處理后對Hela細胞增殖的作用

A：對照組；B：100 μmol/L組；C：150 μmol/L組；D：200 μmol/L組。

圖2 各處理組細胞的流式細胞儀檢測結果

2.2 各組宮頸癌Hela細胞凋亡率比較 Annexin V和PI雙染各處理組細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果顯示，100 μmol/L蛇床子素處理宮頸癌Hela細胞48 h后其凋亡率為(4.42 ± 1.94)%，與對照組(4.34 ± 0.26)%比較，差異無統計學意義(P>0.05)；150 μmol/L和200 μmol/L蛇床子素處理宮頸癌Hela細胞48 h后其凋亡率分別為(9.66 ± 0.12)%和(41.51 ± 0.30)%，與對照組(4.34 ± 0.26)%比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 各組Hela細胞ROS水平比較 利用DCFH-DA法觀察細胞ROS水平，結果顯示，100、150、200 μmol/L蛇床子素處理組細胞內ROS為(1.26±0.04)%、(2.15±0.14)%和(3.12±0.42)%，與對照組(1.00±0.05)%比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

圖3 各組Hela細胞ROS水平比較

2.4 蛇床子素對宮頸癌Hela細胞Bcl-2和Bax mRNA表達的影響 蛇床子素處理48 h后，RT-PCR 檢測Bcl-2和Bax mRNA 的表達，與對照組比較，各蛇床子素藥物處理組Bcl-2 mRNA 表達量下降，而Bax mRNA 表達量明顯升高，Bcl-2/Bax比值顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

A：對照組；B：150 μmol/L組；C：200 μmol/L組；a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

圖4 RT-PCR測定各組Hela細胞Bcl-2和Bax的表達

3 討 論

蛇床子素具有比較廣譜的抗癌作用，對包括胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、白血病、前列腺癌、肺癌等都具有較好的抗癌活性[4-9]。但對于蛇床子素在宮頸癌中的抗癌作用研究較少。本研究對蛇床子素抗人宮頸癌Hela細胞的作用進行了研究，結果顯示蛇床子素能有效地抑制人宮頸癌Hela細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡。

ROS是一類具有比分子氧更活潑的化學反應性的含氧物，主要包括離子狀態的超氧陰離子、羥根離子和非離子狀態的過氧化氫等。正常生理條件下生物體內存在著一套完善的氧化/抗氧化體系，可將ROS維持在一個穩定的范圍內。當ROS過度產生，超過了機體抗氧化防御的能力，就會促使細胞發生轉化、導致惡性腫瘤的發生[10-12]。近年來的研究發現，多種臨床應用的抗癌藥物如三氧化二砷、烷化劑、多柔比星、紫杉醇和喜樹堿等，能通過誘導ROS的大量增加來誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖，從而達到抗癌的目的[10,13-14]。Groninger等[15]用長春新堿(vincristine，VCR)作用于初發急性淋巴細胞性白血病(ALL)患兒的骨髓白血病細胞和ALL細胞株Jurkat細胞。在VCR作用的早期即可在Jurkat細胞檢測到ROS的存在，應用ROS清除劑作用后，ROS的產生被抑制，并且Caspase酶系活性降低，進而抑制Jurkat細胞凋亡。但是，蛇床子素能夠通過誘導ROS的增加來誘導宮頸癌細胞凋亡，目前尚無研究報道。本研究結果顯示，蛇床子素誘導宮頸癌Hela細胞凋亡與其誘導氧化應激、升高ROS水平有關。

越來越多的研究顯示，Bcl-2蛋白家族成員在細胞凋亡的線粒體途徑中起重要調控作用。Bcl-2家族包括兩類功能相反的蛋白質：抑制凋亡的蛋白(Bcl-2、bcl-xL)和誘導凋亡的蛋白(Bax、Bak、Bid和Bim)[11]。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最有代表性的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。在凋亡發生過程中，Bax在某些凋亡相關因素的激活下，可從胞漿遷移至線粒體膜上，Bax形成線粒體膜通道，導致線粒體膜電位無法維系，膜的完整性遭到破壞，從而導致細胞色素C釋放，經過Caspase活化級聯反應，最終導致凋亡發生。本研究發現，當蛇床子素作用于宮頸癌Hela細胞后，Bax mRNA的表達顯著升高，而Bcl-2 mRNA的表達明顯降低，提示蛇床子素通過誘導Bcl-2/Bax失衡，進而促發凋亡。

綜上所述，蛇床子素通過影響宮頸癌細胞ROS水平，打破氧化還原平衡，從而改變線粒體膜通透性，促進激活促凋亡因子Bax，抑制抗凋亡因子Bcl-2，經過級聯反應，誘導細胞凋亡。

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Effect of osthole on apoptosis of human cervical carcinoma Hela cells*

YuYoujiang,PengJianming#,YeJilin,SuLandi,LuoXue

(MedicalCollegeofYangzhouPolytechnicCollege,Yangzhou,Jiangsu225009,China)

Objective To investigate the effect and the possible mechanism of osthole on proliferation and apopotosis of human cervical carcinoma Hela cells and its passible mechanism.Methods After cervical carcinoma Hela cells were incubated with different concentrations osthole，the cell proliferation activity was examined by MTT assay.The apoptosis rate and cellular ROS level were measured by flow cytometry.The Bcl-2 and Bax mRNA expression was determined by semi-quantitative RT-PCR.Results In comparison with the control group，osthole with different concentrations could obviously inhibit the Hela cells proliferation and accelerated the cellular apoptosis，lowered the expression rate of Bcl-2/Bax，raise the cellular ROS level in a osthole dose-dependent manner.Conclusion Osthole may inhibit Hela cell proliferation and accelerates the cells apoptosis，which might be associated with the increasing the cellular ROS level,promoting Bax expression and inhibiting Bcl-2 expression.

uterine cervical neoplasms;osthole;apoptosis

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.006

江蘇省衛生廳衛生職業技術教育科研資助項目(NJ201112)。 作者簡介：于有江(1963-)，副教授，本科，主要從事細胞凋亡、生物化學與分子生物學研究。#共同第一作者：彭建明(1984-)，講師，碩士研究生，主要從事醫學神經生物學研究。

R34

A

1671-8348(2017)07-0883-03

2016-08-16

2016-11-30)