IL-6-174G/C及-572C/G位點基因多態性與新疆NVAF人群及民族差異性分析*

李 娜，王淑霞，木胡牙提

(新疆醫科大學第一附屬醫院健康管理中心健康體檢部，烏魯木齊 830054)

IL-6-174G/C及-572C/G位點基因多態性與新疆NVAF人群及民族差異性分析*

李 娜，王淑霞，木胡牙提△

(新疆醫科大學第一附屬醫院健康管理中心健康體檢部，烏魯木齊 830054)

目的 探討新疆地區白細胞介素-6(IL-6)-174C/G及-572C/G位點的基因多態性，與非瓣膜性心房顫動(NVAF)的關系及新疆地區漢族、哈薩克族(哈族)IL-6基因多態性的民族差異性。方法 分別選擇新疆地區漢族、哈族NVAF對象79、78例(漢族、哈族NVAF組)，漢族、哈族非心房顫動對象75、79例(漢族、哈族對照組)，采集靜脈血提取DNA，采用聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態性(PCR-RFLP)技術對各組對象的IL-6基因-174G/C及-572C/G的多態性進行分析。結果 IL-6 -572G在NVAF組中等位基因頻率明顯高于對照組(χ2=4.076,P<0.05)；NVAF組和對照組IL-6基因-572G/C位點G等位基因頻率比較，差異有統計學意義(OR=1.519，95%CI:1.087～2.122，P<0.05)，而在漢族及哈族對照組中分布差異無統計學意義(P>0.05)；年齡大于或等于75歲(OR=6.468，95%CI:2.427～17.240)、 左心房內徑(OR=1.053，95%CI：1.022～1.085)，是發生房顫的獨立危險因素；左心室射血分數(OR=0.946，95%CI:0.922～0.971)是防止房顫發生的保護因素。各組IL-6基因-174G/C位點 C、G等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0．05)。結論 IL-6-572G/C位點G等位基因是NVAF遺傳易感性的危險因子，IL-6-174G/C位點的基因多態性與心房顫動的易感性無關。

非瓣膜性心房顫動；基因多態性；白細胞介素 6；民族差異

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一，一般人群發生AF率為0.4%～1.0%，80歲以上老年人的發生率高達9%[1]。有研究表明，炎癥因子不僅可以在復律前預測復律的成功率，而且對復律后AF復發的預測有價值[1-2]。AF的發生和持續與白細胞介素(interleukin，IL)及其基因型明顯相關。Terry等[3]報道指出IL-6-174G/C多態性中，C等位基因可增強IL-6的轉錄。鄭金國等[4]報道指出IL-6-572C/G基因多態性中，G等位基因可增強IL-6的轉錄。本研究采用病例對照研究設計對新疆漢族及哈薩克族(哈族)人群中選取上述2個位點的多態性與非瓣膜性心房顫動(non-valvular atrial fibrillation，NVAF)易感性進行相關探討，同時分析上述2個位點是否存在民族差異性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2011年8月在新疆醫科大學第一附屬醫院心臟中心住院明確診斷為NVAF的漢族(n=79)、哈族(n=78)患者。納入標準為NVAF患者有除風濕性心臟病以外的其他心臟病(如冠心病、充血性心肌病等)和全身性疾病(如高血壓、甲狀腺功能亢進、糖尿病等)而同時合并發生AF的漢族及哈族患者。對照組選取與病例組來自同一病區、無AF病史的漢族及哈族患者，所有的心電圖(包括Holter)無AF表現的漢族(n=75)、哈族(n=79)患者。NVAF組和對照組均無血緣關系，無異族通婚家族史，排除合并瓣膜性心臟病、肝腎疾病、2周內外傷、炎癥反應、風濕性疾病及惡性腫瘤患者。本研究已經獲得新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，每例受試者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集各組患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，裝入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內-20 ℃冰箱保存,使用北京天根生化科技有限公司提供的血液基因組DNA 提取系統(RelaxGene Blood DNA System)提取基因組DNA。

1.2.2 引物的設計與合成 參照文獻[3-4]方法設計引物，由大連寶生物工程有限公司合成。IL-6基因-174G/C位點引物序列，上游：5′-GCC AAA GTG CTG AGT CAC-3′，下游：5′-AAT CTT TGT TGG AGG GTG-3′；IL-6基因-572C/G位點引物序列，上游：5′-TGA AGC AGG TGA AGA AAG -3′，下游：5′-TTT CCT CTG ACT CCA TCG-3′。

1.2.3 聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)檢測 采用PCR擴增目的DNA片段,然后將待檢測的DNA片段用限制性內切酶酶切,限制性內切酶識別并切割特異的序列,然后將酶切后的產物進行電泳,再由限制酶圖譜(restriction map)分析此段序列的特異切位點,即由片段的多樣性來比對不同來源基因序列的差異性。基因擴增儀(Applied Biosystem 2720 Thermal Cyeler，美國應用生物系統公司)。PCR反應體系為20.0 μL:上下游引物各0.5 μL,2.5 mmol/L的MgCl23.0 μL，10×緩沖液3.0 μL，0.1 mmol/L的dNTP混合物3.0 μL，多聚酶0.5 U，模板DNA 2.0 μL，去離子水7.0 μL。PCR反應條件：IL-6-174G/C為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，57.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，進行40個循環；最后72 ℃延伸5 min。IL-6-572C/G為94 ℃預變性10 min，94 ℃變性60 s，58.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進行32個循環；最后72 ℃延伸10 min。每批反應均以超純水替代DNA作為陰性對照。

1.2.4 擴增產物限制性酶切 限制性內切酶均為Newlunberd公司產品。IL-6-174G/C擴增產物使用限制性內切酶NlaⅢ，20.0 μL酶切反應體系包括：10×緩沖液2.0 μL，PCR產物10.0 μL，10.0 U限制性內切酶0.5 μL,并加超純水7.5 μL，37 ℃溫浴9 h進行酶切。IL-6-572C/G擴增產物使用BsrBI限制性內切酶，20.0 μL酶切反應體系包括：10×緩沖液2.0 μL，PCR產物10.0 μL，10.0 U限制性內切酶0.5 μL，并加超純水7.0 μL，37 ℃溫浴11 h進行酶切。

1.2.5 基因型判定方法 IL-6-174G/C酶切產物以經3%瓊脂糖在120 V電壓下電泳40 min，IL-6-572C/G酶切產物以經2%瓊脂糖在120 V電壓下電泳30 min，在Gel Doc 2000紫外光凝膠電泳成像分析系統觀察結果。每次酶切反應均以一個確定的純合子基因型作為對照，基因分型結束后，隨機抽取10%的樣本進行重復分型，吻合率達100%。

2 結 果

2.1 IL-6基因多態性 在啟動子-174位點發生了G→C基因替換，產生G、C兩種等位基因。擴增產物片段大小為247 bp，經限制性內切酶消化后，電泳可見3種基因型。若該位點為C，則形成NlaⅢ酶切位點，即為等位基因C；反之，為等位基因G。酶切后得到226、21 bp兩條片段為CC型；247、226、21 bp 3條片段為GC型；單條247片段為GG型(21 bp片段較小在電泳圖上未顯示)。IL-6基因在啟動子-572位點發生了C→G基因替換，產生C、G兩種等位基因。擴增產物片段大小為223 bp，經限制性內切酶消化后，電泳可見3種基因型。若該位點為G，則BsrBI形成酶切位點，即為等位基因G；反之，為等位基因C。酶切后得到154、69 bp兩條片段為CC型；223、154、69 bp 3條片段為GC型；單條223片段為GG型(69 bp片段較小在電泳圖上未顯示)，見圖1、2。

M:標記物；1、3、4、5：GG型；2：GC型。

圖1 IL-6 -174G/C基因型分布

M:標記物；1、6、7：CG型；2、3：GG型；4、5：CC型。

圖2 IL-6-572C/G基因型分布

2.2 各組患者的一般情況比較 NVAF組與對照組患者的一般資料比較，其中高齡(≥75歲)差異有統計學意義(P<0.05)；而平均年齡、性別、體質量指數(BMI)、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、冠心病、心肌病的發生率差異均無統計學意義(P>0.05)。兩組患者心臟超聲結果中左心房內徑(LAD)、左心室射血分數(EF)比較，差異有統計學意義(P<0.05)；右心房內徑(RAD)比較，差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 NVAF與對照組患者的臨床特征及心臟超聲結果比較

續表1 NVAF與對照組患者的臨床特征及心臟超聲結果比較

2.3 Hardy-Weinberg平衡、等位基因及基因型頻率比較 4組患者IL-6-174G/C基因多態性基因型中未出現CC型，GG型檢出率為99.04%，GC型的檢出率為0.96%，分布符合Hardy-Weinberg平衡；NVAF組與對照組基因頻率比較,差異無統計學意義(χ2=3.073，P>0.05)；漢族與哈族基因頻率比較，差異無統計學意義(χ2=0.316P>0.05)，見表2。4組患者IL-6 -572C/G基因多態性基因型中實驗中CC型、GC型、GG型檢出率依次減少，分別為48.87%、34.41%、16.72%，分布符合Hardy-Weinberg平衡；NVAF組與對照組基因頻率比較,差異有統計學意義(χ2=6.018，P<0.05)；漢族與哈族基因頻率比較，差異無統計學意義(χ2=0.008,P>0.05)，見表3。

2.4 多因素分析 將兩組對比差異顯著的危險因素進行Logistic回歸分析，結果顯示IL-6-572C/G等位基因頻率在NVAF組與對照組間差異有統計學意義(P<0.05)。說明G等位基因是非瓣膜性房顫的危險因子，與CC基因型相比，G等位基因存在能夠增加NVAF易感性1.519倍(95%CI:1.087～2.122)。同時高齡、LAD、EF、也與NVAF發生顯著相關(P<0.05)，見表4。

表2 各組患者IL-6 -174G/C基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]

表3 各組患者IL-6-572C/G基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]

a:P<0.05，與哈族、漢族對照組比較。

表4 NVAF患者危險因素多因素非條件Logistic回歸分析

3 討 論

AF發病率近幾年不斷增加，其發生機制探討也相對多元化，在不斷深入研究中，學者們從遺傳學角度，以基因多態性為切入點，開始對AF的發生機制進一步探討。IL-6由T細胞及巨噬細胞產生，主要功能是誘導急性期反應蛋白如CRP、血清淀粉樣蛋白-A等，IL-6基因定位于第7號染色體短臂2l區(7p21)內。有研究發現，IL-6基因啟動子區域存在基因變異和基因多態性，這種多態性與AF的發生和維持密切相關[5-8]。同時，基因頻率會因為種族、環境和地區不同等位基因的分布頻率亦不同[9-10]。因此，研究基因多態性與AF的關系還需進行多種族多民族之間的對照研究。目前國內關于哈族AF基因方面研究報道較少,哈族與漢族人具有不同的遺傳背景及生活習慣,研究哈族、漢族AF的基因多態性的特點將有助于探討新疆地區哈族、漢族人群基因分布情況是否存在差異性。

目前已有研究表明，IL-6-174G/C基因多態性與NVAF有關，這種基因多態性的存在很可能導致IL-6的基因轉錄和表達水平在個體間有差異，從而影響IL-6的生物學水平及其作用，同時指出C等位基因可增強IL-6的轉錄[3]。本研究中發現，漢族及哈族人群中IL-6-174G/C位點只有GG和GC基因型，未見CC型，且基因型及等位基因在病例組和對照組的分布差異無統計學意義(P>0．05)，與國內報道相符[11]，故考慮IL-6-174G/C位點的變異與IL-6基因表達及NVAF的發生、發展沒有明確的關系。研究還說明漢族及哈族IL-6-174G/C位點基因分布的差異無統計學意義(P>0.05)。同時，研究還指出漢族及哈族人群中IL-6-174G/C基因多態性與歐美人種具有不同的頻率分布特征，與日本人群C等位基因頻率為0基本一致[12-13]。

有研究報道，IL-6-572C/G位點G等位基因頻率在AF組分布明顯高于對照組，IL-6-572C/G位點突變的G等位基因可能通過基因調控促進IL-6的高度表達，使血清IL-6水平升高，使機體處于高炎癥狀態[4]。本研究發現，漢族及哈族人群中IL-6-572C/G位點CC型、GC型、GG型檢出率依次為48.87%、34.41%、16.72%，NVAF組與對照組基因頻率比較差異有統計學意義(χ2=6.018，P<0.05)，Logistic回歸分析示G等位基因存在能夠增加NVAF易感性1.519倍(95%CI:1.087～2.122)，G等位基因是NVAF的危險因子。同時，研究還說明漢族及哈族IL-6-572C/G位點基因分布差異無統計學意義(P>0.05)。故IL-6-572C/G位點G等位基因可能是新疆地區漢族及哈族AF發病的遺傳易感基因。IL-6多態位點基因分型檢測能在一定程度上預測AF發病風險，并可為AF防治提供新途徑。

本研究一般資料對比中發現，患者高齡(≥75歲)，OR=6.468，95%CI:2.427～17.240(P<0.01)，考慮高齡是發生AF的危險因素之一，與國內外研究基本相符合，高齡的患者所導致NVAF發生的原因有很多，LAD逐漸擴大，左心耳流速減慢可能是導致NVAF發生率上升的明顯原因[14-15]。本研究結果顯示，NVAF組與對照組相比，LAD大于對照組OR=1.053，95%CI:1.022～1.085(P<0.01)，說明了AF誘發間質纖維化、肌原纖維丟失、糖原積聚及細胞連接結構紊亂等亞細胞結構改變，導致心房直徑增加。同時，NVAF組EF低于對照組OR=0.946，95%CI:0.922～0.971(P<0.01)。說明EF是防止AF發生的保護因素，EF越高患者越不易發生AF。AF時心房肌有效收縮喪失，使舒張期充盈減少及心室收縮功能降低，進一步減少左心室血液充盈及EF。

綜上所述，本研究發現IL-6-572C/G位點G等位基因是NVAF遺傳易感性的危險因子，但在漢族及哈族人群中分布差異無統計學意義(P>0.05);IL-6基因-174G/C位點的多態性與AF的易感性無關，在漢族及哈族人群中分布差異無統計學意義(P>0.05)，同時高齡(≥75歲)、LAD是發生AF的危險因素。EF是防止AF發生的保護因素，EF越高患者越不易發生AF。作者通過分析研究數據得出比較客觀的結果，從而為NVAF危險因素及易感性的分子生物學機制深入研究提供方向。

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Analysis on IL-6-174G/C and -572C/G site gene polymorphism and non-valvular atrial fibrillation population in Xinjiang and national differences*

LiNa,WangShuxia,MuhuYati△

(DepartmentofPhysicalExamination,HealthManagementCenter,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumchi,Xinjiang830054,China)

Objective To investigate the relationship between IL-6-174C/G and-572C/G site gene polymorphism with non-valvular atrial fibrillation(NVAF) as well as the national differences of interleukin-gene polymorphism between Kazak and Han nationality in Xinjiang region.Methods Seventy-nine Kazak patients of NVAF(Kazak NVAF group),78 Han patients with NVFA (Han NVAF group),75 Han cases of non-AF and 79 Kazak cases of non-AF were selected in Xinjiang region.The venous bloods were collected from extracting DNA.IL-6 gene -174G/C and -572C/G polymorphism in various groups were analyzed by adopting the PCR-RFLP technique.Results The allele frequency of IL-6 -572G/C site G in the NVAF group was significantly higher than that in the control group(χ2=4.076,P<0.05).The allele frequency of IL-6 gene -572 G/C site G had statistical difference between the NVAF group and the control group(OR=1.519，95%CI:1.087-2.122，P<0.05),but the distribution difference between the Han and Kazak control groups had no statistical significance(P>0.05);the advanced age ≥75 years old)(OR=6.468，95%CI:2.427-17.240) and left atrial dimension(OR=1.053，95%CI:1.022-1.085) were the independent factors of AF occurrence;the left ventricular ejection fraction was a protective factor for preventing AF occurrence.The allele frequency of IL-6 gene 174G/C site C and G had no statistical difference among various groups(P>0.05).Conclusion The allele of IL-6-572 G/C site G is a risk factor of genetic predisposition in NVAF.IL-6-174G/C site gene polymorphism has no relation with the susceptibility of AF.

non-valvular atrial fibrillation;gene polymorphism;interleukin 6;national difference

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.004

國家自然科學基金資助項目(81260036)；中華醫學會醫學教育分會中國高等教育學會醫學教育專業委員會醫學教育研究項目(2016BQK022)；新疆維吾爾自治區科技計劃軟科學項目(2016D07014)。 作者簡介：李娜(1986-)，住院醫師， 碩士研究生，主要從事心血管疾病的診治研究?！?/p>

，E-mail：muhuyati@163.com。

R541.75

A

1671-8348(2017)07-0875-04

2016-09-11

2016-11-30)