移植免疫耐受中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的依賴性關(guān)系研究*

李姝蓉，趙高平，楊卯竹，魏玲玲，鄧紹平

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610054；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院/電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院器官移植研究所，成都 610072；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院/電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，成都 610072)

移植免疫耐受中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的依賴性關(guān)系研究*

李姝蓉1,2，趙高平1,3△，楊卯竹2，魏玲玲2，鄧紹平1,2

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610054；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院/電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院器官移植研究所，成都 610072；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院/電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，成都 610072)

目的 探討在聯(lián)合抗Tim-1/抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的移植耐受中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的關(guān)系。方法 建立BALB/c小鼠到C57BL/6小鼠的同種胰島移植長期耐受模型，將長期耐受小鼠(LTS)的B細(xì)胞過繼輸注至接受胰島移植的B細(xì)胞缺陷小鼠(μMT-/-)體內(nèi)，或加用抗CD25抗體(PC61)去除CD25+Treg細(xì)胞，觀察移植物的存活時間，用流式細(xì)胞儀檢測Foxp3+Treg數(shù)量變化。將CD4+Foxp3-GFP-T細(xì)胞與Bregs細(xì)胞聯(lián)合過繼輸注RAG小鼠體內(nèi)，檢測Foxp3+GFP+T細(xì)胞的擴(kuò)增情況。建立小鼠皮膚移植模型，在雙抗體治療的同時加用抗CD20抗體祛除B細(xì)胞，觀察對Tregs數(shù)量的影響。結(jié)果 繼承性轉(zhuǎn)移長期耐受小鼠的Bregs可誘導(dǎo)83.3%的小鼠長期耐受，但加用抗CD25 單抗后，胰島移植物在較短時間(MST=20 d)內(nèi)全部被排斥；繼承性轉(zhuǎn)移長期耐受小鼠Bregs可使Tregs數(shù)量明顯增加(P<0.01)，并且可誘導(dǎo)CD4+Foxp-T細(xì)胞表達(dá)Foxp3；用抗CD20抗體祛除B細(xì)胞后，雙抗體誘導(dǎo)的皮膚移植受體小鼠體內(nèi)Tregs數(shù)量明顯減少(P<0.01)。結(jié)論 在雙抗體誘導(dǎo)的移植耐受中，Bregs可能通過促進(jìn)Tregs生成而延長移植物的存活。

移植耐受；調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性

移植免疫耐受是指受者對移植器官抗原特異性應(yīng)答的T 細(xì)胞與B 細(xì)胞，在抗原刺激下，不能被激活，不能產(chǎn)生特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞及特異性抗體，從而不能執(zhí)行正常免疫應(yīng)答的現(xiàn)象。20世紀(jì)50年代，Billingham等[1]首次在新生的小鼠模型中成功誘導(dǎo)了免疫耐受，這在免疫學(xué)的發(fā)展史上具有里程碑的意義 。在誘導(dǎo)免疫耐受的方法中，誘導(dǎo)抗原特異性的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生和增殖是一種有效的途徑。負(fù)責(zé)免疫調(diào)控的細(xì)胞主要包括調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)和調(diào)節(jié)性B 淋巴細(xì)胞(regulatory B cells,Bregs)。Tregs是不同于Th1和Th2的具有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體，已有多項(xiàng)研究證實(shí)CD4+CD25+Treg具有免疫抑制作用。而近年來的研究表明，還存在有部分Bregs，也可通過其他多種調(diào)節(jié)機(jī)制，如分泌白細(xì)胞介素10(IL-10)、生長轉(zhuǎn)化因子β(TGF-β)等，發(fā)揮免疫抑制功能，介導(dǎo)移植免疫耐受。本研究旨在探索此兩類調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞之間的聯(lián)系，有助于闡明Bregs與Tregs之間的相互作用機(jī)制，為建立以調(diào)節(jié)性細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療方式提供全新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 WT C57BL/6小鼠(B6,H-2b) 55只，B細(xì)胞缺陷小鼠C57BL/6(μMT-/-B6,H-2b) 57只，BALB/c 小鼠(H-2d) 249只，F(xiàn)oxp3-GFP小鼠10只(C57BL/6背景)，B6 RAG小鼠10只，以上小鼠均為雄性，體質(zhì)量25～35 g，購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，于清潔級的小鼠標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物房飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑 大鼠抗小鼠CD45RB抗體(HB220)、抗Tim-1抗體(RTM1-10)及抗CD25 抗體(PC61)購自美國Bio X Cell公司；抗CD20抗體(5D2)購自美國Genentech公司；LPS、鏈脲佐菌素(STZ)及Ficoll 400購自美國Sigma-Aldrich公司；Collagenase P購自美國Roche公司。 藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗小鼠Foxp3 單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠CD4 單克隆抗體等免疫熒光染料均購自美國eBioscience 公司。MACS免疫磁珠B 細(xì)胞分離試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 (1)將接受胰島移植的32只糖尿病受體B6 μMT-/-小鼠分為4組，每組8只，分別為無B細(xì)胞組、naive B細(xì)胞組、LTS B細(xì)胞組和LTS B細(xì)胞+PC61組。(2)將25只糖尿病受體B6 μMT-/-小鼠分為5組，每組5只。2組小鼠不接受胰島移植，分別為naive B細(xì)胞組、LTS B細(xì)胞組；3組小鼠接受胰島移植，分別為單純移植組、移植+naive B細(xì)胞組、移植+LTS B細(xì)胞組。(3)將接受胰島移植的10只糖尿病B6 RAG小鼠分為2組，每組5只，分別為CD4+Foxp3-GFP-T細(xì)胞+naive B細(xì)胞共輸注組(naive B共轉(zhuǎn)移組)和CD4+Foxp3-GFP-T細(xì)胞+LTS B細(xì)胞共輸注組(Breg共轉(zhuǎn)移組)。(4)將30只正常C57BL/6(B6)小鼠分為5組，每組6只，其中1組不進(jìn)行皮膚移植，為naive組；其余4組分別為皮膚移植組、皮膚移植+雙抗體組、皮膚移植+CD20組、皮膚移植+雙抗體+CD20組。

1.2.2 胰島移植 為建立小鼠胰島移植模型，先將鏈脲佐菌素按200 mg/kg劑量注射于C57BL/6(B6)或B6 μMT-/-小鼠腹腔內(nèi)，誘導(dǎo)糖尿病模型，Balb/C小鼠作為胰島供體，用Collagenase P酶消化胰腺后再采用Ficoll 400 梯度分離法分離出胰島細(xì)胞，手工挑選500個胰島細(xì)胞移植到受體腎臟包膜下。抗Tim-1抗體500 μg在移植前1 d、300 μg在移植當(dāng)天和第5天腹腔內(nèi)注射；抗CD45RB抗體100 μg在移植后0、1、3、5、7 d腹腔注射；抗CD25抗體(PC61)250 μg在移植后1、6 d腹腔注射；抗CD20抗體 10 mg/kg 移植前8 d，5 mg/kg 移植當(dāng)天腹腔注射。監(jiān)測血糖，如連續(xù)2 d超過11.1 mmol/L，則判斷為排斥。

1.2.3 皮膚移植 供體為BALB/c小鼠，受體為C57BL/6 小鼠。脫頸椎法處死供體BALB/c 小鼠，用剃毛器剃去背部鼠毛;取全厚度軀干部皮膚，組織剪和手術(shù)刀去除皮下脂肪及血管，剪成直徑約為1 cm×1 cm的方形皮片，置于無菌PBS中備用。C57BL/6受鼠腹腔注射戊巴比妥納(50 mg/kg)麻醉。制備受鼠背部移植床，將供體皮片置于移植床，縫合固定，無菌凡士林紗布覆蓋，創(chuàng)可貼包扎固定，單籠飼養(yǎng)?？笴D45RB抗體和抗Tim-1抗體用法同胰島移植，抗CD20抗體在移植前8、0 d，腹腔注射250 μg。每天觀察移植物有無水腫、炎癥、壞死、結(jié)痂和脫落等排斥情況，當(dāng)移植皮片壞死超過80%即可認(rèn)為完全排斥。

1.2.4 繼承性細(xì)胞轉(zhuǎn)移 (1)B細(xì)胞過繼輸注：分別取出雙抗體治療后胰島移植物長期存活的受體小鼠，以及未使用任何治療的野生小鼠脾臟，碾碎過濾后調(diào)成細(xì)胞懸液，用B細(xì)胞分離試劑盒及免疫磁珠細(xì)胞分選儀陰性選擇出B細(xì)胞(純度大于95%)。將5×106B細(xì)胞通過尾靜脈注入受體B6 μMT-/-。(2)CD4+Foxp3-GFP-T細(xì)胞與B細(xì)胞聯(lián)合過繼輸注： 取BALB/c小鼠胰島移植到B6小鼠，并按上述方法注射抗Tim-1/抗CD45RB抗體誘導(dǎo)耐受。2周后，取受體小鼠和未經(jīng)任何處理的B6小鼠脾臟，分別用磁珠分選獲得Breg和naive B細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分選Foxp3-GFP小鼠的CD4+Foxp3-GFP-T細(xì)胞，將4.5×106該細(xì)胞聯(lián)合12×106分選出的Breg或naive B細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入接受移植的糖尿病B6 RAG小鼠。

1.2.5 流式細(xì)胞檢測 獲取脾臟，研磨后，用70 μm的尼龍網(wǎng)過濾，HBSS沖洗獲得脾細(xì)胞懸液。裂解紅細(xì)胞，洗滌，收集剩余細(xì)胞并用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。6孔板加含有0.1%疊氮化鈉和2%胎牛血清的PBS，每孔加1×106個/mL。加入熒光標(biāo)記的CD4，F(xiàn)oxp3抗體。Foxp3需固定破膜后再熒光標(biāo)記。上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5.0版處理，生存分析采用Wilcoxon統(tǒng)計分析，CD4+Foxp3+Treg表達(dá)組間分析采用Student′st檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠排斥反應(yīng)及生存時間比較 移植后未輸注任何細(xì)胞的μMT-/-B6小鼠和輸注naive B細(xì)胞的μMT-/-B6小鼠都在較短時間內(nèi)發(fā)生排斥反應(yīng)，最長存活天數(shù)分別為21、23 d。而輸注了LTS B細(xì)胞的6只μMT-/-B6小鼠中，有5只(83.3%)移植物存活時間超過了100 d[平均存活時間(MST)≥37 d]。但是，用抗CD25 單抗(PC61)抑制CD25+Treg后，即使在移植當(dāng)天同時接受LTS B細(xì)胞輸注，受體μMT-/-B6小鼠也全部發(fā)生排斥，MST僅為23.2 d，見表1。

表1 各組小鼠排斥反應(yīng)及生存時間比較

a：P<0.01，與LTS B細(xì)胞組比較。

2.2 各組小鼠脾臟中Foxp3+Treg數(shù)量比較 單純移植組的小鼠、未移植的LTS B細(xì)胞組的小鼠，以及接受移植并輸注了naive B細(xì)胞的小鼠脾臟中Foxp3+Treg數(shù)量均無明顯增加。只有接受移植并輸注了LTS B細(xì)胞的小鼠脾臟中的Foxp3+Treg明顯增加(P<0.01)，見圖1。

2.3 Bregs誘導(dǎo)CD4+Foxp-T細(xì)胞表達(dá)Foxp3 CD4+Foxp3-GFP-T細(xì)胞與naiveB細(xì)胞共轉(zhuǎn)移的小鼠脾臟內(nèi)CD4+Foxp3+T細(xì)胞所占比例為7.37%，而與Breg共轉(zhuǎn)移的小鼠脾臟內(nèi)該細(xì)胞的比例為13.30%，后者達(dá)到前者的1.80倍，見圖2。

2.4 去除Bregs導(dǎo)致雙抗體誘導(dǎo)的Tregs減少 與只用雙抗體誘導(dǎo)的皮膚移植組相比，加用抗CD20抗體祛除B細(xì)胞后，受體小鼠的CD4+T細(xì)胞中Foxp3+T細(xì)胞所占比例明顯下降(P<0.01)，見圖3。

1:單純移植組；2：naive B細(xì)胞組；3：LTS B細(xì)胞組；4：移植+naive B細(xì)胞組；5：移植+LTS B細(xì)胞組；a:P<0.05,b：P<0.01,與移植+LTS B細(xì)胞組比較。

圖1 各組小鼠脾臟中Foxp3+Treg數(shù)量比較

圖2 Bregs誘導(dǎo)CD4+ Foxp- T細(xì)胞表達(dá)Foxp3

1：naive組；2：皮膚移植組；3：皮膚移植+CD20組；4：皮膚移植+雙抗體組；5：皮膚移植+雙抗體+CD 20組；a:P<0.01，與皮膚移植+雙抗體組比較。

圖3 祛除Bregs導(dǎo)致雙抗體誘導(dǎo)的Tregs減少

3 討 論

B細(xì)胞是另外一種最主要的免疫細(xì)胞，過去普遍認(rèn)為其在獲得性免疫反應(yīng)過程中通過自身抗體或遞呈抗原而扮演致病性角色。然而，新近研究證實(shí)部分B細(xì)胞也可發(fā)揮免疫抑制功能，介導(dǎo)移植免疫耐受，將這部分B細(xì)胞稱為Bregs。在多個移植模型中，繼承性轉(zhuǎn)移B細(xì)胞可延長胰島移植物的存活時間[2-4]。但Tregs在B細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫耐受過程中的作用研究甚少。本研究在同種異體小鼠胰島移植模型基礎(chǔ)上，采用雙抗體誘導(dǎo)形成長期耐受的小鼠，之后發(fā)現(xiàn)過繼性輸注LTS小鼠脾臟B細(xì)胞的確可誘導(dǎo)糖尿病B6 μMT-/-受體對胰島移植物的耐受。但當(dāng)Tregs的功能被抗體抑制后，耐受則不能形成，提示Bregs誘導(dǎo)耐受還需要Tregs的參與。

本研究進(jìn)一步檢測了過繼性輸注Bregs后Tregs的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)移植后接受B細(xì)胞輸注的受體小鼠脾臟中，CD4+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量與naive B共轉(zhuǎn)移組相比有明顯增加。并且，通過CD4+Foxp3-GFP-T細(xì)胞與B細(xì)胞的聯(lián)合輸注，證明Bregs在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)Tregs的增殖。此外，為了驗(yàn)證Tregs是受Bregs誘導(dǎo)而增加，本研究在小鼠同種異體皮膚移植模型中，用抗CD20抗體抑制B細(xì)胞，與作者的設(shè)想相符，B細(xì)胞被抑制后，雙抗體誘導(dǎo)的Tregs顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)了Bregs與Tregs之間存在相互作用的關(guān)系。在Langier等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞可以誘導(dǎo)80%接受皮膚移植的小鼠形成耐受，且耐受個體的移植部位浸潤的CD4+T細(xì)胞中90%為CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞，該結(jié)果支持本研究中Bregs通過誘導(dǎo)CD4+Foxp3+Treg形成而促使移植物耐受的結(jié)論。

然而，Bregs到底是通過何種方式來促進(jìn)CD4+Foxp3+Treg的增殖還尚未可知。Bregs最早提出是由于其可以分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10，進(jìn)而調(diào)控免疫應(yīng)答[6-7]。這種B10細(xì)胞也是目前研究最為廣泛，最被認(rèn)可的一種Bregs的亞群。已有體外實(shí)驗(yàn)表明，IL-10對于Tregs的分化起促進(jìn)作用[8-9]。同時，Carter等[10]發(fā)現(xiàn)患有自身免疫性關(guān)節(jié)炎的小鼠大量缺失可分泌IL-10的Bregs后，F(xiàn)oxp3+Treg的數(shù)量隨之減少，從而導(dǎo)致其病情加重。由此作者猜測在本實(shí)驗(yàn)的移植模型中，Bregs也可能是通過分泌IL-10來誘導(dǎo)Tregs增加，但該猜想需要得到進(jìn)一步的證實(shí)。

與上述猜想不符的是，Texier等[11]發(fā)現(xiàn)，輸注耐受個體的B細(xì)胞能夠誘導(dǎo)同種異體大鼠心臟移植耐受，并且可同時檢測到移植受體外周血中有CD4+CD25+Treg細(xì)胞的積聚，但分泌IL-10的Bregs卻沒有增多。該結(jié)果提示，誘導(dǎo)Tregs形成的并非為IL-10，而可能是其他的細(xì)胞因子。早在2004年，日本的Sakaguchi[12]就證實(shí)TGF-β在免疫耐受中起重要作用，是一種有效的誘導(dǎo)Tregs的細(xì)胞因子。之后在一項(xiàng)關(guān)于小鼠氣道過敏反應(yīng)性疾病的體外實(shí)驗(yàn)中，研究人員選擇性地轉(zhuǎn)移了B細(xì)胞分泌的TGF-β后，小鼠的肺部炎癥和哮喘均得到改善，并證實(shí)是由TGF-β誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+Foxp3+Tregs，才使免疫反應(yīng)得以抑制[13]。

此外，Kessel等[14]在一項(xiàng)關(guān)于人體Bregs與Tregs的體外研究中發(fā)現(xiàn)，雖然TGF-β可以誘導(dǎo)Tregs表達(dá)Foxp3，但并非是通過細(xì)胞因子來間接發(fā)揮作用，Bregs與Tregs直接的細(xì)胞接觸才是誘導(dǎo)Tregs擴(kuò)增的主要機(jī)制，因?yàn)楫?dāng)兩種細(xì)胞分開培養(yǎng)時，F(xiàn)oxp3的表達(dá)幾乎沒有增加。

目前，國內(nèi)外對Bregs與Tregs的相關(guān)性研究中，大多數(shù)均圍繞體外試驗(yàn)或自身免疫性疾病。而在移植免疫領(lǐng)域，尤其是針對實(shí)驗(yàn)動物模型的體內(nèi)研究則少有報道。本研究中，在建立大量的實(shí)體動物移植模型的基礎(chǔ)上，得出了Bregs可能促進(jìn)Tregs的擴(kuò)增而延長移植物存活的結(jié)論。為更進(jìn)一步闡明移植免疫耐受機(jī)制提供了新的思路，同時豐富了移植免疫耐受機(jī)制的基礎(chǔ)理論。然而，在接受移植的受體內(nèi)部環(huán)境中，Bregs與Tregs是否也通過IL-10或TGF-β相互作用；是否還存在其他相關(guān)細(xì)胞因子的參與；Bregs與Tregs直接接觸的具體作用機(jī)制，如是否存在特定的信號通路；以及是否還存在其他可能的作用機(jī)制等問題都有待進(jìn)一步研究。

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Dependence relationship between regulatory B cells and regulatory T cells in transplantation immune tolerance*

LiShurong1,2,ZhaoGaoping1,3△,YangMaozhu2,WeiLingling2，DengShaoping1,2

(1.MedicalSchool,UniversityofElectronicScienceandTechnology,Chengdu,Sichuan610054,China; 2.InstituteofOrganTransplantation,SichuanProvincialAcademyofMedicalScience/SichuanProvincialPeople′sHospital/AffiliatedHospital,UniversityofElectronicScienceandTechnology,Chengdu,Sichuan610072,China;3.DepartmentofGastrointestinalSurgery,SichuanAcademyofMedicalScience·SichuanProvincialPeople′sHospital/AffiliatedHospital,UniversityofElectronicScienceandTechnology,Chengdu,Sichuan610072,China)

Objective To investigate the relationship between regulatory B cells (Bregs) and regulatory T cells(Tregs) in transplantation tolerance induced by dual anti-CD45RB/anti-TIM-1 antibody.Methods The longterm murine islet allograft transplant models from BALB/c to C57BL/6 were established.B cells purified from longterm survivors (LTS)were adoptively transferred to grafted B cell-deficient μMT-/-B6 recipients and treated with or without PC61.The allograft survival time was analyzed and the number of Foxp3+Treg cells was examined by flow cytometry.Murine skin allograft transplant models was established and treated with dual antibody.The change of the percentage of Treg cells was observed after B-cell depletion using anti-CD20 antibody.Results Adoptive transfer of Bregs in longterm tolerated murines could induce longterm tolerance in 83.3% of murines.But after adding CD25m monoclonal antibody,islet grafts were completely rejected in a short time(MST=20 d);adoptive transfer of Bregs in longterm tolerated murines could increase the Tregs number(P<0.01),moreover could induce CD4+Foxp-T cell to express Foxp3;after deleting B cells with CD20 antobody,Tregs cells number in the skin transplant recipient murine induced by dual antibody was remarkably reduced (P<0.01).Conclusion In transplantation tolerance induced by dual antibody，Breg cells may prolong the graft survival time possibly through promoting Treg generation.

transplantation tolerance;regulatory B cells;T-lymphocytes,regulatory

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172832，81571565)；四川省杰出青年基金資助項(xiàng)目(2013JQ0020)；四川省青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)計劃(2014TD0010)；四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會課題(110190)。 作者簡介：李姝蓉(1992-)，在讀碩士研究生，主要從事胰島移植相關(guān)免疫細(xì)胞研究。△

，E-mail：gzhao@uestc.edu.cn。

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1671-8348(2017)07-0868-03

2016-08-26

2016-11-09)