Wnt信號通路在姜黃素誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡中作用機制

趙軼峰 楊永江 王曉元 梁晚平 李秀娟 黃 迪 高曉斌 魏玉磊

Wnt信號通路在姜黃素誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡中作用機制

趙軼峰 楊永江 王曉元 梁晚平 李秀娟 黃 迪 高曉斌 魏玉磊

目的 探討Wnt通路在姜黃素誘導人乳腺癌 MCF-7細胞凋亡中的作用機制。方法 將MCF-7細胞培養液隨機分為5組，分別加入15、30、60、120 μmol/L的姜黃素，對照組不加，培養 12，24，48 h 后采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。分A、B兩組(劑量組、時間組) 采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(FCM)觀測細胞凋亡及細胞周期分布；Western Blotting法檢測A、B兩組的Wnt通路相關蛋白，并進行相應的相關性分析探討Wnt通路與乳腺癌MCF-7細胞凋亡的關系。結果 CCK-8結果顯示，隨培養時間延長，姜黃素各濃度組MCF-7細胞增殖抑制率逐漸增高(均P<0.05)；在同一時間點，隨著姜黃素濃度升高，細胞增殖抑制率逐漸增高(均P<0.05) 。FCM染色結果顯示，隨著姜黃素濃度增加、作用時間延長MCF-7細胞凋亡指數逐漸上升(均P<0.05)，且G1/S期細胞增加越多(P<0.05)。Western Blotting實驗結果顯示MCF-7細胞中Wnt1、β-catenin的表達下調程度呈現劑量時間依賴性 (P<0.05)。相關性分析顯示細胞抑制率、G0/G1期細胞百分比、細胞凋亡率均與Wnt 通路相關蛋白Wnt1、β-catenin的表達呈現較明顯的相關性(P<0.05)。結論 姜黃素的抗癌活性與抗增殖能力具有明顯的劑量時間依賴性，且Wnt通路在姜黃素誘導乳腺癌MCF-7細胞抑制、凋亡過程中發揮了重要作用。

Wnt信號通路;姜黃素;MCF-7細胞;細胞凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:188～191)

姜黃素是提取于天然中草藥中的1種植物多酚，毒性低下，具有廣泛的抗炎、抗氧化、降血脂、抗突變、抗腫瘤的藥理作用。有研究指出姜黃素對多種腫瘤有明顯的抑制或殺傷作用，且參與人體多條信號通路的調控，Wnt 信號便是重要的一條[1]。經典Wnt 信號通路(Wnt/β-catenin 通路)由細胞外的配體(Wnt 家族分子)、細胞膜的受體(Frizzled家族分子和 LRP-5/6)、胞漿內的信號傳導蛋白(Dsh、APCAxin、GSK-3β、CK-1、β-catenin 等)及核內轉錄調控部分(TCF/LEF1 家族)組成[2]，參與了多項生物學功能的調控，主要是通過調節胞質β-catenin的磷酸化與降解進行的。正常情況下，大部分β-catenin與 E 鈣黏附蛋白(E-cadherin) 和細胞骨架蛋白(Actin)結合，以穩定形式存在；只有少部分與細胞質中的APC)、GSK3β 及Axin 結合形成“降解復合物”，隨后進行降解使胞質內游離的 β-catenin 維持在低水平，難以進入細胞核。一旦有了Wnt 信號，可以與跨膜受體 Frizzled 家族分子和 LRP-5/6 結合，并作用于胞質內的 Dvl，破壞降解 β-catenin 的多蛋白復合物，使得非磷酸化 β-cateninβ-catenin 在細胞質的水平得到累積，轉位進入細胞核，激Wnt 相關靶基因(C-myc、Cyclin D1等)[3-4]。Wnt 通路的關鍵是胞漿中是否存在結構穩定的、可溶性的β-catenin[5]。Wnt通路的失調及過度激活與多種癌癥(結腸癌、胃癌、乳腺癌等)的發生發展相關。然而目前對姜黃素在腫瘤細胞中發揮生物學作用的精確靶點還不十分清楚。本研究本研究將姜黃素作用于乳腺癌 MCF-7 細胞，觀察姜黃素對乳腺癌 MCF-7 細胞的生長及 Wnt 信號通路的影響，并探討Wnt通路在姜黃素誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡中機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人乳腺癌 MCF-7，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。將細胞單層接種在DMEM 培養液(購自美國GIBCO公司，含 10%FBS 、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素，無菌過濾)中,在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養，待細胞密度長至80%時對其用0.25%胰酶及0.02% EDTA將貼壁生長的細胞用直接吹打法傳代。過夜待其貼壁后,取對數生長期細胞進行實驗。

1.2 姜黃素配制

姜黃素(試劑純度>95%)，由河北北方學院生命科學研究中心提供。采用二甲基亞砜(DMSO)進行溶解,配制成 1 mmol/L 待用，儲存于-20 ℃冰箱進行冷凍保存。試驗時根據所需的濃度(0、15、30、60、120 μmol/L)將儲存的姜黃素進行稀釋，其中不含藥的細胞培養液組作為空白對照組。并按所需濃度向人乳腺癌 MCF-7細胞中加入姜黃素溶液，細胞處理 12 h、24 h、48 h后進行相關實驗。

分為A、B兩組進行FCM及Western blot實驗。A組為劑量組,即0、15、30、60、120 μmol/L姜黃素處理24 h;B組為時間組,即用60 μmol/L姜黃素處理12 h、24 h、48 h。

1.3 CCK-8法檢測細胞抑制率

細胞活性計數試劑盒CCK8 (Cell Counting Kit 8)源自日本。將細胞培養處于對數生長期的MCF-7細胞用0.25%胰蛋白酶消化離心，并調整細胞株密度至8×104個細胞/ml，接種于96孔板中，培養24 h待細胞貼壁后棄去培養液，并加入用培液稀釋的0、15、30、60、120 μmol/L姜黃素，每組設4個平行孔,100 nl/L每孔，每孔終體積為200 μl。繼續作用培養24 h、48 h后，照試劑盒說明書更換培養液(加入CCK-8試劑，放在37 ℃培養箱中共同孵育4 h)；分別對作用24 h、48 h后的培養液用自動酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度(OD)值，重復3次實驗，并計算細胞抑制率。并根據細胞存活率對藥物劑量對數作圖求出IC50值。

細胞抑制率=(OD對照組-OD實驗組)/OD對照組×100%

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(FCM)檢測MCF-7細胞的誘導凋亡及細胞周期

加姜黃素12 h、24 h、48 h后以0.25%胰蛋白酶消化收集MCF-7細胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(FCM)說明(bender公司)操作,取出295 μl細胞懸液加入5 μlAnnexin V-FITC混勻并且室溫放置10 min。用PBS洗滌細胞2次并重新加入290 nl/L的Binding緩沖液以重懸細胞，并加入10 nl/L 的10 μg/ml的PI (Propidium Iodide)，輕輕混勻，4 ℃避光反應15 min，加入200 nl/L預冷的IX混合緩沖液中，混勻后立即上機檢測。使用 guava 微流式細胞分析儀Nexin程序進行細胞凋亡率的檢測，測定細胞數為 10 000個，重復3次實驗。

1.5 Western Blot 法檢測蛋白表達

取對數生長期人乳腺癌MCF-7細胞并接種于6孔培養板，在分別用0、15、30、60、120 μmol/L姜黃素處理細胞培養箱培養48 h后收集細胞后，RIPA裂解細胞提取細胞總蛋白，配膠，高溫變性。將變性的蛋白以80 μg/30 μL 每孔上樣進行SDS-PAGE 電泳，電泳后轉膜至PVDF，5%脫脂牛奶封閉2 h。結合適當濃度的一抗4 ℃冰箱過夜后充分清洗，再分別與對應的 HRP 標記的二抗室溫孵育2 h，顯色采用eECL法，數據采集與分析采用OmegaLum G成像系統。重復3次實驗。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度姜黃素對MCF-7 細胞增殖的影響

15、30、60、120 μmol/L姜黃素在不同時間點的細

胞抑制率比較差異均有統計學意義(F=4.080,P=0.036;F=7.358,P=0.027;F=9.636,P=0.001;F=13.441,P≤0.001)，兩兩比較顯示呈明顯時間依賴性；同一時間點，15、30、60、120 μmol/L姜黃素的細胞抑制率比較差異均有統計學意義(F=5.981,P=0.022;F=10.080,P<0.001;F=14.650,P<0.001)，兩兩比較顯示呈明顯劑量依賴性，見表1。另外，不同濃度姜黃素作用于MCF-7細胞48 h后，姜黃素生物活性(IC50)測定為21.6 μmol/L。

表1 不同濃度姜黃素的MCF-7 細胞抑制率

注：a為與對照組比較,P<0.05;b為與15 μmol/L比較，P<0.05;c為與30 μmol/L比較,P<0.05;d為與60 μmol/L比較,P<0.05。1為與姜黃素組12 h比較,P<0.05;2為與姜黃素組24 h比較,P<0.05。

2.2 不同濃度姜黃素對 MCF-7 細胞凋亡的影響

MCF-7細胞培養24 h后(A組),0、15、30、60、120μmol/L姜黃素組凋亡率分別為0.87%、5.21%、7.80%、19.45%、30.31%，差異均有統計學意義(P<0.001)；細胞周期分布顯示姜黃素濃度越高G1/S期細胞增加越多(P<0.001)，見表2。加入60 μmol/L姜黃素培養12 h、24 h、48 h后的凋亡率分別為6.89%、19.45%、22.12%，差異均有統計學意義(P<0.001)，顯示姜黃素作用時間越長使得G1/S期細胞增多越明顯(P<0.05)。具體結果見表3。

表2 不同濃度姜黃素對MCF27細胞周期和 凋亡率的檢測結果/%

注：a為與對照組比較,P<0.05;b為與15 μmol/L比較，P<0.05;c為與30 μmol/L比較,P<0.05;d為與60 μmol/L比較,P<0.05。

表3 不同作用時間MCF-7細胞周期和凋亡情況/%

注：1為與姜黃素組12 h比較,P<0.05;2為與姜黃素組24 h比較,P<0.05。

2.3 姜黃素對Wnt通路相關蛋白(Wnt1、β-catenin)表達的影響

MCF-7細胞培養24 h后(A組),0、15、30、60、120 μmol/L姜黃素組的Wnt1、β-catenin蛋白表達量的差異均有統計學意義(P均<0.05)；加入60 μmol/L姜黃素培養12 h、24 h、48 h后的Wnt1、β-catenin蛋白表達量的差異均有統計學意義(P均<0.05)。具體見表4。

2.4 Wnt通路相關蛋白表達與MCF-7細胞的抑制、周期及凋亡的相關性

通過對A、B兩組的24次的檢測結果進行相關性分析，結果顯示：細胞抑制率、G0/G1期細胞百分比、細胞凋亡率均與Wnt 通路相關蛋白Wnt1、β-catenin的表達呈明顯相關性(P<0.05)，提示Wnt 通路在姜黃素誘導MCF-7細胞增殖抑制及凋亡過程中具有重要作用。具體見表5。

表4 乳腺癌細胞中Wnt1、β-catenin的蛋白 表達量

注：a為與對照組比較,P<0.05;b為與15μmol/L比較，P<0.05;c為與30 μmol/L比較,P<0.05;d為與60 μmol/L比較,P<0.05。1為與姜黃素組12 h比較,P<0.05。

表5 Wnt通路相關蛋白表達與細胞凋亡的相關性(n=24)

3 討論

對于預后較差的乳腺癌，多重耐藥與復發一直存在，僅依靠外科手術難以根治，多采取集手術、化放療、內分泌治療、生物治療、物理康復治療和中醫中藥治療等多種治療方式于一體的綜合手段，以提高乳腺癌的治愈率及生存率。因此，積極探索新的治療領域是乳腺癌治療研究的熱點，包括中醫藥治療。既往大量細胞及動物實驗均證明，姜黃素具明顯的抗突變、抗腫瘤的生物活性，且抗癌譜較廣、毒副作用小,應用前景廣泛[6]。Wnt信號是一參與人體細胞多種復雜的生化反應的調節通路，近年來許多研究指出其余多種惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用，針對與乳腺癌等的研究也較多，均指出乳腺癌組織中存在著異常 Wnt通路，導致乳腺癌的發生和發展[7]。但目前對于Wnt信號通路在姜黃素誘導乳腺癌細胞凋亡中如何發揮作用尚待不確切。

本研究中經姜黃素作用過的MCF-7細胞出現了顯著的細胞抑制及凋亡反應，且表現出明顯的劑量與時間依賴性，作用劑量越大、作用時間越長，抗癌活性越高，抗增殖能力及殺傷能力就越強。從細胞周期分布來看,姜黃素使MCF-7細胞阻滯在G0/S期，無法進入下一增殖周期。正常情況下細胞周期阻滯時，細胞能夠通過自我修復、開啟細胞凋亡系統，受損細胞凋亡。而在腫瘤細胞中無法實現自我修復，從而出現細胞失控、無限增殖的現象。姜黃素是一種可以抑制細胞的增殖的TPK 抑制劑，且能夠誘導細胞發生停滯在G0/S期，因而促進細胞發生凋亡。這一結果提示姜黃素抑制細胞增殖發揮抗腫瘤作用的機制之一是通過影響細胞周期分布，引起細胞代謝紊亂,導致細胞重新分化進行的，這與相關研究結果一致[8-10]。

Wnt通路的功能障礙異常、Wnt信號激活或細胞，導致β-catenin水平失控是腫瘤發生的重要原因。因此，抗腫瘤是從封閉異?；罨腤nt 信號通路入手，達到誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖的目的，甚至已經有人嘗試以該通路為靶點來進行腫瘤治療嘗試[11]。Wnt1 蛋白是由 Wnt 基因編碼的分泌糖蛋白，是Wnt 通路的組成部分，主要通過其下游的DSH 、β-catenin、APC 等去磷酸化和磷酸化過程來完成 Wnt 信號傳遞。Wieczorek M 等人就曾通過阻斷Wnt-1 信號達到了誘導人乳腺癌細胞 MCF-7 細胞凋亡的目的[12]。β-catenin是Wnt通路的經典信號，可進入細胞核并堆積在核內，引起腫瘤的發生。本研究姜黃素作用于 MCF-7 細胞24 h后，Wnt1、β-catenin隨著姜黃素劑量的增加其蛋白表達量越低；同在60 um/L姜黃素作用12 h、24 h、48 h的Wnt1、β-catenin的蛋白表達量呈現逐漸降低的趨勢。提示姜黃素抑制乳腺癌細胞增殖抑制與凋亡可能與Wnt通路的調控有關。進一步的相關性分析顯示細胞抑制率、細胞周期分布、細胞凋亡均與Wnt1、β-catenin的表達呈現較明顯的相關性(P<0.05)。因此，本研究的結果可以說明姜黃素誘導乳腺癌MCF-7 細胞凋亡可能由于影響了經典的 Wnt/β-catenin途徑引起的。正常狀態下細胞胞質內游離 β-catenin 濃度處于相對較低水平，β-catenin失控造成腫瘤發生。姜黃素后能夠封閉異?；罨腤nt 信號，有效降低β-catenin 水平及與Wnt相關的其他蛋白。但是Wnt 基因激活的原因尚不清楚，如果我們想把Wnt 信號通路與治療靶點聯系起來，尚缺乏足夠的證據。且腫瘤細胞與多條信號通路交織復雜，我們還需要考慮各條信號通路之間的交互作用，展開進一步的研究。

[1] 龍 麗,曹友德.姜黃素對乳腺癌MDA-MB-231細胞NOTCH1和NF-κB表達的影響〔J〕.腫瘤防治研究,2010,37(2):158-161.

[2] 李學慶,鄒文俊.參姜膠囊對腫瘤抑制作用的研究〔J〕.實用癌癥雜志,2013,28 (5):462-464.

[3] 劉 洋,張晨光,周春燕.經典 Wnt/β-catenin 信號通路中的雙向調控〔J〕.北京大學學報:醫學版,2010,42(2):238-242.

[4] 徐 東,楊小龍.Wnt-1或Wnt/beta-catenin信號通路在惡性腫瘤中研究進展〔J〕.實用癌癥雜志,2010,25(3):326-327.

[5] Wnt 基因/Wnt 信號通路與乳腺癌〔J〕.中國生物化學與分子生物學報,2011,27(2):125-129.

[6] 謝碧琛,李國利.Wnt 基因/Wnt 信號通路與乳腺癌〔J〕.中國生物化學與分子生物學報,2011,27(2):125-129.

[7] 孫 黎,劉正泉,羅 強,等.姜黃素體外誘導人乳腺癌MCF-7 細胞凋亡作用〔J〕.河北北方學院學報(醫學版),2009,8(4):23-25.

[8] 吳軍召,郭曉霞,王承正,等.姜黃素對人乳腺癌 MCF -7 細胞增殖及血管生成相關基因表達的影響 〔J〕.醫藥論壇雜志,2011,32 (2):95-97.

[9] 薛茗方.姜黃素抗乳腺癌的作用及其機制研究〔D〕.吉林大學,2014.

[10] 吳曉健,吳凱南.姜黃素對人乳腺癌 MCF-7 細胞抗增殖作用的研究〔J〕.第三軍醫大學學報,2006,28(18):1870-1872.

[11] 張 英,祁 鑫,朱小云,等.參堿對人乳腺癌 MCF-7 細胞的生長抑制作用及其機制研究〔J〕.現代腫瘤醫學,2014,22 (3):494-497.

[12] Wieczorek M，Paczkowska A,Guzenda P,et al.Silencing of wnt-1 by sirna induces apoptosis of mcf-7 human breast cancer cells〔J〕.Cancer Biol Ther，2008，7(2):268-274.

(編輯：吳小紅)

Role of Wnt Signaling Pathway in Curcumin-induced Apoptosis of Breast Cancer Cells MCF-7

ZHAOYifeng,YANGYongjiang,WANGXiaoyuan,etal.

FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,075061

Objective To investigate the mechanism of Wnt pathway in curcumin-induced apoptosis of human breast cancer cells MCF-7.Methods The MCF-7 cells were randomly divided into 5 groups,respectively received 15,30,60 and 120μmol/L curcumin,and the control group,CCK-8 cells were cultured for 12,24 and 48 hours to detect proliferative capacity.Apoptosis and cell cycle distribution were observed by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry (FCM).The Wnt pathway of group A and group B was detected by western blotting method.And to explore the relationship between the Wnt pathway and the apoptosis of breast cancer MCF-7 cells.Results CCK-8 showed that the proliferation inhibition rate of MCF-7 cells increased gradually with the increase of curcumin concentration (P<0.05);at the same time point,with the increase of curcumin concentration,the inhibition of cell proliferation (P<0.05).FCM staining showed that the apoptotic index of MCF-7 cells increased gradually with the increase of curcumin concentration (P<0.05) and the increase of G1/S phase cells (P<0.05).Western blotting results showed that the expression of Wnt1 and β-catenin in MCF-7 cells was dose and time dependent (P<0.05).The correlation analysis showed that the percentage of cells,G0/G1phase, apoptosis rate were closely correlated with the expression of Wnt1 and β-catenin (P<0.05).Conclusion The anticancer activity and antiproliferative ability of curcumin have a dose and time dependent manner,and Wnt pathway has a significant effect on the expression of Wnt1 and β-catenin in curcumin-induced breast cancer MCF-7 cells,and it plays an important role in the process of apoptosis.

Wnt signaling pathway;Curcumin;MCF-7 cells;Apoptosis

河北省衛生廳科研基金項目(編號：20150468)

075061 河北北方學院附屬第一醫院

梁晚平

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.005

R737.9

A

1001-5930(2017)02-0188-04

2016-12-12

2017-01-12)