肺炎支原體培養(yǎng)鏡下觀察與其CCU相關(guān)性分析

吳振起 ，馬 融，岳志軍， 魏 巍

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是各年齡段兒童急性上、下呼吸道感染的常見病原，其年感染發(fā)病率為9.6%～66.7%，每隔3～8 a流行一次，并可在密閉環(huán)境如學(xué)校、幼托機(jī)構(gòu)、夏令營等暴發(fā)[1-2]。隨著大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的日益嚴(yán)峻，難治性MP肺炎病例有逐年增加的趨勢[3]。MP感染嚴(yán)重影響兒童的身體健康，已引起國內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注。開展MP相關(guān)基礎(chǔ)研究迫在眉睫，而MP的培養(yǎng)和菌力判定是限制MP研究的瓶頸問題之一。MP菌力及濃度的判定往往借助于顏色改變單位(colour change unite，CCU)的測定。已測定CCU的MP經(jīng)過凍存-復(fù)蘇-培養(yǎng)-傳代-培養(yǎng)……，其CCU往往發(fā)生了變化。為驗(yàn)證能否在MP培養(yǎng)的過程中，通過倒置顯微鏡下觀察MP的濃度和分布，估算其CCU，本研究通過鏡下觀察MP培養(yǎng)濃度和分布范圍，確定其分級，并與測定的CCU和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ PCR)測定結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 MP標(biāo)準(zhǔn)株FH由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基主要成分為PPLO培養(yǎng)基、無菌胎牛血清、新鮮酵母浸液、葡萄糖、青霉素和酚紅等(調(diào)整pH值為7.6左右)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 FQ PCR 試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司),內(nèi)參是GAPDH(三磷酸甘油醛脫氫酶)，H1: 5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3′，H2: 5′-TGGAAATTGTGAGGGAGATGC-3′，擴(kuò)增特異片段長度為336 bp，胎牛血清(Hyclone)。

1.1.4 儀器設(shè)備 倒置熒光顯微鏡(Leica LEZTDML)，低溫高速離心機(jī)(德國BIOFUGE28RS)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏LCⅡ)，超低溫冰箱(日本MDF-382E)。

1.2 方法

1.2.1 MP菌株培養(yǎng)及菌落測定 將凍存的MP接種至液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃,含5% CO2、飽和氮的厭氧培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)液顏色由紅變黃時(shí)進(jìn)行連續(xù)傳代，取第3代。