Paraconiothyiumvariable GHJ-4木質素降解酶的酶學性質*

王鳳娟 李偉慶 牟志美 王彥文 劉慶信 高繪菊

(山東農業大學林學院 泰安 271018)

ParaconiothyiumvariableGHJ-4木質素降解酶的酶學性質*

王鳳娟 李偉慶 牟志美 王彥文 劉慶信 高繪菊

(山東農業大學林學院 泰安 271018)

【目的】 研究木質素降解子囊菌ParaconiothyriumvariabileGHJ-4分泌的漆酶(laccase)、錳過氧化物酶(MnP)和木質素過氧化物酶(LiP)3種木質素降解酶的酶活性變化規律及其酶學性質，為利用該菌株進行木質素降解酶的工業化生產和應用提供依據。【方法】 分別以愈創木酚、2,6-二甲基苯酚和黎蘆醇為底物測定laccase，MnP和LiP的酶活性，研究3種酶的最適反應溫度和pH、溫度和pH穩定性及金屬離子對其活性的影響?！窘Y果】 GHJ-4菌株發酵18，15和21天后，分別獲得laccase，MnP和LiP最高酶活為1 390.3，30.3和52.5 U·mL-1。laccase的最適反應溫度為55 ℃左右，最適反應pH為5.5左右，在55 ℃以下、pH 4.0～7.0的范圍內較為穩定； MnP的最適反應溫度為60 ℃左右，最適反應pH為5.0左右，在55 ℃以下、pH 4.0～9.0的范圍內較為穩定； LiP的最適反應溫度為40 ℃左右，最適反應pH為3.0左右，在40 ℃以下、pH 2.0～4.0的范圍內較為穩定。Mg2+，Zn2+，Cu2+，K+對laccase起促進作用，Na+和Zn2+對LiP起促進作用，Mn2+對MnP起激活作用，而Fe3+，Ca2+，Pb2+，Co2+，Al3+對3種酶均起抑制作用，其中尤以5 mmol·L-1Fe3+對3種酶的抑制作用最強?！窘Y論】 溫度、pH及金屬離子對ParaconiothyriumvariabileGHJ-4 3種木質素降解酶的酶學特性均有著不同程度的影響。關鍵詞：ParaconiothyriumvariabileGHJ-4； 漆酶； 錳過氧化物酶； 木質素過氧化物酶； 酶學性質

木質素是一類以苯丙烷為基本單元的結構復雜且穩定的芳香族生物大分子物質(董旭杰等， 2007； 段傳人等， 2009)，同時也是地球上僅次于纖維素、第二豐富的可再生資源，約占植物生物量的25%(Adler， 1977)。在自然環境條件下，木質素的完全降解是真菌、細菌、放線菌及相應微生物群落共同作用的結果，其中真菌起主導作用(崔艷紅等， 2012)。木質素生物降解過程主要涉及3種細胞外酶： 漆酶(laccase)、錳過氧化物酶(MnP)和木質素過氧化物酶(LiP)(Abrah?oetal.， 2008； Leonowiczetal.， 2001； 蘇小軍等， 2009； 池玉杰等， 2009)。laccase(EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于擔子菌、子囊菌和植物中，其中真菌漆酶來源廣泛，在合適的氧化還原輔基存在條件下，可參與木質素的降解過程(尤紀雪等， 2008； 金春德等， 2009； 王娟等， 2010)。MnP(EC1.11.1.13)是一種最常見依賴H2O2降解木質素的含亞鐵血紅素糖蛋白酶，在木腐菌和各種棲息土壤的枯落層降解擔子菌中廣泛存在(Orthetal.， 1993； Hatakka， 1994)。LiP(EC1.11.1.14)與MnP同樣也是一類含亞鐵血紅素輔基的過氧化物酶，最早由Glenn等(1983)從黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)中發現，并與其他木質素降解酶相互作用將木質素徹底氧化為CO2和H2O(喻云梅等， 2005； 王敏， 2011； 李阿敏等， 2015)。

目前，國內外報道的產生木質素降解酶的菌株主要局限于白腐菌中的擔子菌，如黃孢原毛平革菌、變色栓菌(Trametesversicolor)、糙皮側耳(Pleurotusostreatus)等菌種，而關于子囊菌產木質素降解酶的研究報道相對較少。ParaconiothyriumvariabileGHJ-4是本實驗室從泰山腳下一腐朽柳木中分離到的1株木質素降解子囊菌(GenBank注冊號為GQ331986)(Gaoetal.， 2011)，本研究對ParaconiothyriumvariabileGHJ-4菌株產生laccase，MnP和LiP的情況進行檢測，并研究其酶學性質，旨在查明GHJ-4降解木質素的主要酶系，為今后利用該菌株進行木質素降解酶的工業化生產和應用以及深入研究GHJ-4降解木質素的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

1.1.1 菌株 子囊菌ParaconiothyriumvariabileGHJ-4，由本實驗室自行篩選并保存。

1.1.2 培養基 PDA培養基： 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，加水定容至1 000 mL，用于GHJ-4菌株的活化。

產酶培養基： 酒石酸銨10 mL(22 g·L-1)，葡萄糖2.5 mL(200 g·L-1)，大量元素15 mL，微量元素15 mL，VB13 mL(100 mg·L-1)，加水至50 mL，pH 4.2。其中大量元素： KH2PO420 g·L-1，MgSO4·7H2O 13.8 g·L-1，CaCl21 g·L-1，NaCl 0.6 g·L-1； 微量元素： MnSO4·H2O 0.35 g·L-1，FeSO4·7H2O 60 mg·L-1，CoCl·6H2O 110 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 60 mg·L-1，CuSO4·5H2O 95 mg·L-1，AlK(SO4)2·12H2O 6 mg·L-1，H3BO36 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 6 mg·L-1(張文婷， 2011)。

1.2 GHJ-4的培養方法和酶液制備

在250 mL三角瓶中放入80 mL產酶培養基，接種直徑為10 mm的GHJ-4菌餅3個，28 ℃、160 r·min-1條件下進行搖床培養，于特定時間取出，4 ℃、4 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液為粗酶液，-80 ℃保存備用。

1.3 木質素降解酶酶活測定

1.3.1 漆酶活性的測定 采用Gao等(2013)方法，在4.0 mL含1.0 mmol·L-1愈創木酚的50 mmol·L-1pH 4.5的醋酸鈉緩沖液中加入1.0 mL適當稀釋的酶液，充分混勻后30 ℃反應30 min，冰浴中終止反應，測定465 nm處的吸光度(ε465=36 000 L·cm-1mol-1)。定義每分鐘氧化1 μmol·L-1愈創木酚所需酶量為酶活單位U，其計算公式為：

(1)

式中：VT，VE分別代表反應體系的總體積和反應酶液的體積；ε為吸光系數。

1.3.2 錳過氧化物酶活性的測定 采用Wariishi等(1992)方法，向pH 4.5的3.36 mL 50 mmol·L-1的丙二酸鈉緩沖液中依次加入0.2 mL 10 mmol·L-1的MnSO4、0.2 mL 10 mmol·L-1的2,6-DMP、0.2 mL酶液樣品和40 μL10 mmol·L-1的H2O2，25 ℃下保溫5 min，于470 nm處測定吸光度(ε470=496 000 L·cm-1mol-1)。定義每分鐘氧化1 μmol·L-12,6-DMP所需酶量為酶活單位U，計算方法同1.3.1。

1.3.3 木質素過氧化物酶活性的測定 采用Gao等(2011)方法，在4 mL體系中加入2.5 mL酒石酸緩沖液(100 mmol·L-1，pH 3.0)、1.0 mL 10 mmol·L-1藜蘆醇、0.1 mL 10 mmol·L-1H2O2和0.4 mL酶液，于37 ℃測定酶反應前3 min內在310 nm處的吸光度(ε310=9 300 L·cm-1mol-1)，酶促反應由加入H2O2后而啟動。定義每分鐘氧化1 μmol·L-1藜蘆醇所需酶量為酶活單位U，計算方法同1.3.1。

1.4 木質素降解酶酶學性質測定

1.4.1 pH對木質素降解酶活性及穩定性的影響 取適量酶液分別置于pH 2.0～9.0的緩沖體系中，測定3種酶的酶活，確定最適反應pH； 將酶液置于pH 2.0～9.0的緩沖體系中25 ℃下保溫1 h，測定剩余酶活，以酶活最高者為100%計算相對酶活。

1.4.2 溫度對木質素降解酶活性及穩定性的影響 將酶液分別在20～90 ℃下測定酶活，確定最適反應溫度； 將酶液分別在20～90 ℃保溫1 h后測定剩余酶活，以酶活最高者為100%計算相對酶活。

1.4.3 金屬離子對木質素降解酶活性的影響 在酶液中分別加入KCl，NaCl，CaCl2，FeCl3，MgCl2，ZnCl2，MnCl2，CoCl2，AlCl3，CuCl2，(CH3COO)2Pb至終濃度為0.1，1.0，5.0 mmol·L-1，25 ℃保溫1 h，測定剩余酶活，以未添加金屬離子的酶活為100%計算相對酶活。

1.5 數據處理

每個測試組樣品平行測定3次，取平均值，所有試驗數據運用Microsoft Excel數據處理系統進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 培養時間對GHJ-4產木質素降解酶的影響

由圖1A和圖1B可知，GHJ-4菌株在接種后的第9 天，laccase出現一分泌高峰，之后又經歷下降、重新升高，到18 天時達到最高值1 390.3 U·mL-1； MnP和LiP的分泌規律與laccase相類似，其中MnP在第15天達到最高酶活30.3 U·mL-1，LiP在第21天達到最高酶活52.5 U·mL-1。因此分別選取18，15和21天的發酵液進行laccase，MnP和LiP酶學特性的測定。

圖1 培養時間對GHJ-4產木質素降解酶的影響Fig.1 Effect of incubation time on ligninolytic enzymes produced by GHJ-4

2.2 pH對GHJ-4木質素降解酶活性及穩定性的影響

2.2.1 pH對GHJ-4木質素降解酶活性的影響 分別在不同pH反應體系下測定GHJ-4木質素降解酶的酶活，結果如圖2所示。由圖2可知，GHJ-4菌株laccase的最適反應pH為5.5左右，pH4.5～6.5時相對酶活在80%以上，pH>6.5時酶活迅速下降，pH 9.0時僅有少量酶活； MnP的最適反應pH為5.0左右，pH 4.5～7.0時相對酶活為在80%以上，pH>7.0時酶活呈現緩慢下降趨勢，pH 9.0時相對酶活仍為63%； LiP的最適反應pH為3.0左右，pH 2.0～4.0時相對酶活在80%以上，pH>4.0時酶活迅速下降，pH 9.0時已經幾乎檢測不到酶活。

2.2.2 pH對GHJ-4木質素降解酶穩定性的影響 將酶液置于不同pH的緩沖液中保存1 h后測定木質素降解酶剩余酶活，結果如圖3所示。由圖3可知，laccase在pH 5.0～6.5時穩定性較好，酶活可保持在80%以上，pH>7.0時酶活損失較快； MnP有較寬的pH穩定性范圍，pH 4.5～9.0時酶活均保持在80%以上，pH 9.0時仍能保持81%的酶活； LiP在酸性條件下較堿性條件下穩定，pH 3.0～3.5時酶活相對穩定，保持在80%以上，pH 3.5時，酶活迅速下降，pH 7.0時，相對剩余酶活僅為40%。

2.3 溫度對GHJ-4木質素降解酶活性及穩定性的影響

2.3.1 溫度對GHJ-4木質素降解酶活性的影響 分別在不同溫度下測定GHJ-4木質素降解酶的酶活，結果如圖4所示。由圖4可知，GHJ-4木質素降解酶均在一定溫度范圍內隨溫度升高其酶活不斷增強，laccase的最適反應溫度為55 ℃左右，在45～60 ℃之間均有較高酶活，相對酶活在80%以上，之后酶活迅速下降； MnP的最適反應溫度為60 ℃左右，55～70 ℃之間相對酶活在80%以上，超過70 ℃酶活迅速下降； LiP的最適反應溫度為40 ℃左右，35～55 ℃之間相對酶活在80%以上，超過55 ℃酶活明顯下降。當反應溫度為90 ℃時，3種酶酶活均檢測不到。

圖2 pH對GHJ-4木質素降解酶活性的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme activity of ligninolytic enzymes produced by GHJ-4

圖3 GHJ-4木質素降解酶的pH穩定性Fig.3 Effect of pH on stability of ligninolytic enzymes produced by GHJ-4

圖4 溫度對GHJ-4木質素降解酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity of ligninolytic enzymes produced by GHJ-4

2.3.2 溫度對GHJ-4木質素降解酶穩定性的影響 將酶液分別在不同溫度下保溫1 h后測定剩余酶活，結果如圖5所示。由圖5可知，laccase，MnP和LiP的相對酶活隨著保存溫度的升高迅速下降，laccase和MnP在55 ℃以下相對穩定，當溫度超過55 ℃時，酶活迅速下降； 而LiP在40 ℃以下相對穩定，當溫度超過45 ℃時，酶活呈現迅速下降趨勢。

圖5 GHJ-4 木質素降解酶的熱穩定性Fig 5 Effect of temperature on stability of ligninolytic enzymes produced by GHJ-4

2.4 金屬離子對木質素降解酶活性的影響

將酶液置于不同濃度的金屬離子緩沖液中保存1 h后測定剩余酶活，結果如表1所示。 從表1可看出，Mg2+，Zn2+，Cu2+和K+對laccase有促進作用，Mn2+，Fe3+，Ca2+，Pb2+，Co2+，Na+，Al3+對laccase都表現出一定程度的抑制作用，其中Fe3+，Ca2+，Pb2+和Co2+抑制作用較強； Mn2+對MnP有激活作用，其他金屬離子在某種程度上都存在著對MnP的抑制作用，其中Fe3+和Pb2+抑制作用最為明顯； Na+，Zn2+對LiP具有激活作用，而其他金屬離子均存在不同程度的抑制作用，其中Mg2+，Fe3+，Ca2+，Pb2+，Co2+，Al3+的抑制作用較強。可見Fe3+和Al3+對3種酶都存在著一定程度的抑制作用，其中Fe3+為5 mmol·L-1時抑制作用最強。

表1 不同金屬離子對酶活的影響

3 討論

關于木腐真菌培養條件的研究報道，不同菌株即使是同一菌株不同培養條件，其產酶的最佳時間也不相同。laccase的最佳產酶時間為36 h～32天(周菲， 2011； 宋安東等， 2005)，MnP的最佳產酶時間為7～24天(張連慧， 2005； 宋安東等， 2005)，LiP的最佳產酶時間為4～24天(楊暖， 2009； 宋安東等， 2005)。本文通過研究GHJ-4所分泌的3種木質素降解酶隨時間的變化規律，得到laccase，MnP和LiP的最佳產酶時間分別為18，15和21天，這與前人的研究結果基本一致。

關于木質素降解酶酶學性質的研究，大多認為laccase的最適反應溫度為20～65 ℃，溫度穩定性為25～60 ℃； 最適反應pH為4.0～5.5，pH 3.5～8.0范圍內均有較高酶活(董學衛等， 2007； 趙曉燕等， 2012； 肖楚等， 2011； 王維樂， 2011)。MnP的最適反應溫度為35～55 ℃，溫度穩定性為20～50 ℃，最適反應pH為3.0～7.0，pH 2.5～9.0范圍內均有較高酶活(程曉濱， 2007； 吳會廣， 2008； 白娜， 2010)。LiP的最適反應溫度為35～50 ℃，溫度穩定性為15～60 ℃，最適反應pH為2.5～7.0，pH 2.0～9.0范圍內均有較高酶活(孔令營等， 2010； 楊暖， 2009； 金劍等， 2010)。本研究中GHJ-4分泌的laccase最適反應溫度55 ℃，55 ℃以下相對穩定，最適反應pH為5.5，pH 4.0～7.0穩定性較好； MnP最適反應溫度60 ℃，55 ℃以下相對穩定，最適反應pH為5.0，pH 4.0～9.0較為穩定； LiP最適反應溫度40 ℃，40 ℃以下穩定，最適反應pH為3.0，pH 2.0～4.0穩定。這表明LiP較laccase和MnP熱穩定性差，laccase,LiP較MnP的pH穩定性范圍窄，與其他白腐真菌木質素降解酶相比，除MnP最適反應溫度略高外，其他酶學性質基本一致。

本研究中Mg2+，Zn2+，Cu2+，K+對laccase起激活作用，Na+和Zn2+對LiP起促進作用，Mn2+對MnP起促進作用，而Fe3+，Ca2+，Pb2+，Co2+，Al3+對3種酶都起抑制作用，其中以Fe3+的抑制作用最明顯，濃度為5 mmol·L-1時，對3種酶活性的抑制率達到80%～100%，這與其他報道(肖楚等， 2011； 王維樂， 2011； 吳會廣， 2008； 徐淑霞等， 2007； 金劍等， 2010； 張莉， 2009)有很大不同，說明同種金屬離子對不同菌種木質素降解酶的影響不同，可能與其化學組成和分子結構不同有關。

為了更好地將GHJ-4進行工業應用，目前本實驗室正通過對其降解酶進行分子改造和異源表達來進一步提高其反應溫度和pH，相關研究正在進行中。

4 結論

本研究通過對木質素降解子囊菌ParaconiothyriumvariabileGHJ-4進行發酵培養，明確了GHJ-4所分泌的3種木質素降解酶隨時間的變化規律； 通過研究金屬離子對GHJ-4產3種木質素降解酶活性的影響，證明即使是同種金屬離子對不同菌種木質素降解酶的影響也不同，這可能與其化學組成和分子結構不同有關。研究結果為下一步進行該菌株木質素降解酶的分子改造以及木質素降解研究提供了重要的理論依據，對該菌株木質素降解酶的工業化生產、開發和利用具有重要的理論和實踐意義。

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(責任編輯 石紅青)

Enzymological Characteristics of Ligninolytic Enzyme fromParaconiothyriumvariabileGHJ-4

Wang Fengjuan Li Weiqing Mu Zhimei Wang Yanwen Liu Qingxin Gao Huiju

(CollegeofForestry，ShandongAgriculturalUniversityTai’an271018)

【Objective】 The production and enzymological characteristics of ligninolytic enzymes, including laccase, manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP) produced byParaconiothyriumvariabileGHJ-4 were investigated. This study could provide theoretical data for commercial process and application ofParaconiothyriumvariabileGHJ-4 ligninolytic enzymes.【Method】Laccase, MnP and LiP activity were measured with guaiacol, 2,6-Dimethylphenol and veratryl alcohol as substrate respectively. Effects of temperature, pH value and metal irons on three ligninolytic enzymes were assayed. 【Result】Laccase, MnP and LiP activity reached the peak value of 1 390.3 U·mL-1, 30.3 U·mL-1and 52.5 U·mL-1respectively on the 18th, 15thand 21stday during the fermentation. The optimum temperature and pH of laccase were 55 ℃ and 5.5 respectively, and the enzyme activity was stable under 55 ℃ and pH 4.0-7.0. The optimum temperature and pH of MnP were 60 ℃ and 5.0 respectively, and the enzyme activity was stable under 55 ℃ and pH 4.0-9.0. The optimum temperature and pH of LiP were 40 ℃ and 3.0 respectively, and the enzyme activity was stable under 40 ℃ and pH 2.0-4.0. Laccase activity was enhanced by the metal ions Mg2+，Zn2+，Cu2+，K+, LiP activity was enhanced by Na+and Zn2+, and MnP activity was enhanced by Mn2+. Whereas three ligninolytic enzymes were inhibited by Fe3+, Ca2+, Pb2+, Co2+and Al3+, especially the effect of Fe3+was the strongest.【Conclusion】 The effects of temperature, pH and metal ions on activities of ligninolytic enzymes fromParaconiothyriumvariabileGHJ-4 were different.

Paraconiothyriumvariabile GHJ-4; laccase; manganese peroxidase(MnP); lignin peroxidase(LiP); enzyme characterization

10.11707/j.1001-7488.20170112

2015-08-21；

2015-11-02。

國家自然科學基金項目(31200450)； 中國博士后科學基金項目(2013M541944)； 山東省現代農業產業技術體系蠶桑產業創新團隊建設資助項目(SDAIT-18-05)。

Q933

A

1001-7488(2017)01-0094-07

*高繪菊為通訊作者。