5-氮雜-2’-脫氧胞苷對人臍靜脈內皮細胞血管生成的影響及機制研究

陳 涵，萬守謙，張紅霞，崔治晶

（甘肅省康復中心醫院，甘肅 蘭州 730030）

5-氮雜-2’-脫氧胞苷對人臍靜脈內皮細胞血管生成的影響及機制研究

陳 涵，萬守謙，張紅霞，崔治晶

（甘肅省康復中心醫院，甘肅 蘭州 730030）

目的 觀察5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）血管生成的影響，并初步探討其機制。方法 采用MTT法檢測5-Aza-CdR對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響，利用Transwell小室研究5-Aza-CdR對HUVECs細胞遷移的影響，利用Matrigel膠模擬細胞外基質成分分析5-Aza-CdR對HUVECs細胞管樣結構形成的影響，通過W estern Blot法檢測其對HUVECs細胞血管內皮生長因子受體（VEGFR 2）表達的影響。結果 5-Aza-CdR可有效抑制HUVECs細胞增殖，且效果呈劑量、時間依賴性，1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L 5-Aza-CdR在24 h時對HUVECs細胞的增殖抑制率分別為（2.5±0.2）%、（12.7±0.2）%和（29.3±0.2）%，差異有顯著性（P＜0.05）；在72 h時對HUVECs細胞的增殖抑制率分別為（12.6±0.7）%、（67.1±0.2）%和（95.8±1.2）%，差異有顯著性（P＜0.05）。與對照組相比，各濃度5-Aza-CdR均對HUVECs的遷移表現出顯著的抑制作用。當濃度為1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L時，抑制率分別為12.8%、28.6%、59.4%。不同濃度的5-Aza-CdR可明顯抑制管樣結構形成，1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的5-Aza-CdR對管樣結構形成的抑制率分別為19.3%、37.2%和74.6%。用不同濃度的5-Aza-CdR處理HUVECs后，VEGFR 2表達的下調呈劑量依賴性。結論 5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs細胞增殖、遷移和管樣結構形成，其機制可能與下調HUVECs細胞膜表面VEGFR 2的表達有關。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷；人臍靜脈內皮細胞；遷移；管樣結構；血管內皮生長因子受體

1 資料與方法

1.1 一般資料

腫瘤血管生成的過程極為復雜，從血管內皮細胞（Endothelial Cell，ECs）活化、遷移、增殖，到形成管樣結構，再由多個血管芽之間相互連接從而形成血管網狀結構[1]。通過抑制內皮細胞活化、遷移和增殖過程，能夠明顯抑制腫瘤新生毛細血管生長，從而達到抑制腫瘤發生、發展以及轉移的目的。目前，已有多種抗血管生成藥物處于臨床前實驗或臨床研究階段[2，3]，但是由于有多條信號轉導通路參與血管生成，僅抑制其中一條信號轉導通路，腫瘤仍有其他轉導途徑，易產生耐藥性。因此，尋求通過多種途徑達到抗腫瘤效應的藥物有助于提高療效并減少耐藥性產生。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）具有抑制DNA甲基轉移酶1（DNMT1）酶的甲基轉移活性作用，已被應用于多種血液系統疾病的治療[4]。目前有研究證實[5～7]，5-Aza-CdR對實體腫瘤的發生、發展以及轉移有抑制作用，對其機制的研究仍局限于去甲基化，其對內皮細胞血管生成的影響及機制目前國內外均無報道。我們通過觀察5-Aza-CdR對人靜脈內皮細胞（HUVECs）遷移、增殖及管樣結構形成的影響，初步闡明5-Aza-CdR對內皮細胞血管生成的影響及可能機制，進一步驗證其是否同時通過去甲基化和抑制腫瘤血管新生兩條途徑達到抑制腫瘤發生、發展及轉移的目的，以期為5-Aza-CdR在實體腫瘤治療中的應用提供理論依據。

1.2 材料的獲取

1.2.1 細胞株及細胞培養 人臍靜脈內皮細胞購自中國科學院細胞生物研究所，均在含有10%小牛血清的RPMI 1640培養液中培養，置于37℃、5%CO2及95%濕度的培養箱中培養。在細胞進入對數生長期時，用2×105/m l的起始濃度傳代，傳代時用0.25%的胰酶（含0.02%EDTA）溶液消化，取第3代細胞用于實驗。用MTT法檢測5-Aza-CdR對HUVECs細胞增殖的影響。實驗組：取對數生長期細胞用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）溶液消化，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液制作單細胞懸液，以每孔1×105個細胞分別接種于96孔培養板中，每孔體積100μl，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養箱中培養24 h，待細胞完全貼壁后，加入5-Aza-CdR，調整每孔終體積為200μl，并使5-Aza-CdR終濃度為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L。對照組不加5-Aza-CdR，僅加等體積的培養液，每組設置3個平行孔，在每塊培養板中留一孔不加細胞，只加培養液，設為空白調零孔，繼續培養，分別在24 h、72 h時，取出培養板，在每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃繼續孵育4 h，倒去孔內培養液，在每孔中加入150μl的DMSO，之后將培養板置于平板搖床上振蕩10min，使結晶充分溶解，以空白孔調零，用酶聯免疫檢測儀檢測570 nm波長處每孔光密度值（OD值），從而計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.2.2 細胞遷移 取對數生長期人臍靜脈內皮細胞，以0.25%的胰酶消化，用培養基制成細胞懸液后，稀釋細胞懸液濃度至5× 105/m l，加入Transwell小室，待細胞沉降數分鐘后，再加入不同濃度的5-Aza-CdR（1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L）懸液和藥液，共加入400μl，下室加入含20%血清的培養基600μl，待細胞遷移24 h后取出小室，將上室細胞以棉棒輕輕拭去，用甲醇固定30min，結晶紫染色5min，PBS洗滌3次，鏡下觀察遷移結果并照相。管樣結構形成實驗的鋪膠：分裝Matrigel膠，于-20℃保存。實驗前一天取出置于4℃冰箱中，使其充分融化。將滅菌槍頭放于-20℃冰箱中，供第二天實驗用。實驗當天，Matrigel膠與培養基以1∶2稀釋，在96孔板的每個孔均加入60 μl，置于37℃孵箱中凝固30min。

1.2.3 細胞處理 在37℃、5%CO2條件下培養HUVECs細胞。取對數生長期細胞，倒去原培養液，加入0.25%的胰酶0.8m l消化，用培養基制作成單細胞懸液，之后進行細胞計數。用培養基稀釋細胞，使細胞濃度降至8×105/m l（加入0.5%的血清），將其加入Matrigel膠已凝固的96孔板中，每孔90μl，細胞沉降數分鐘后，再加入不同濃度的5-Aza-CdR（1μmol/L、5μmol/L、10 μmol/L）10μl，繼續置于培養箱中培養8 h后，鏡下觀察管樣結構形成情況，照相并行結果分析。Western Blot法檢測5-Aza-CdR對HUVECs細胞血管內皮細胞生長因子受體（VEGFR2）表達的影響：取對數生長期HUVECs細胞，用D-Hanks液洗滌細胞3次后，分別加入已配好的不同濃度的5-Aza-CdR（1μmol/L、5 μmol/L、10μmol/L）和培養基，24 h后棄掉原培養液，以移液器吸凈培養瓶中殘存的培養液，用3m l的4℃預冷PBS（0.01 M，pH 7.2～7.3）洗滌細胞。輕晃30min，倒去洗滌液，重復兩次，PBS除盡后每瓶細胞中再加入270μl裂解液，置于冰上裂解1.5 h，期間持續晃動使細胞充分裂解，待裂解完成后，用刮棒將細胞刮下，置于培養瓶的一側，迅速將裂解液轉移到1.5m l離心管內，4℃、13 000 r/min條件下，離心15min，取上清液分裝。將以上樣品置于沸水中煮沸5 min，使蛋白變性，之后在每加樣孔中加入20μl含有5×SDS上樣緩沖液的樣品。上樣前，用掌式離心機將樣品稍離心，用50μl微量進樣器吸取樣品，然后將進樣器的針頭插入加樣孔緩慢加入樣品。每次加樣品前用電泳緩沖液清洗3次進樣器，防止各孔間交叉污染。在其中一孔加入Marker，用于蛋白分子量對照。之后進行電泳和轉膜，用脫脂奶粉封閉后加入目的一抗，在4℃條件下孵育過夜，TBS/T洗滌3次后，加入二抗，于室溫孵育2 h，再次使用TBS/T洗滌3次后進行化學發光并照相。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 5-Aza-CdR可有效抑制HUVECs細胞增殖

結果顯示，5-Aza-CdR可有效抑制HUVECs細胞增殖，且效果呈劑量時間依賴性。1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L濃度5-Aza-CdR在作用24 h時，對HUVECs細胞的增殖抑制率分別為（2.5±0.2）%、（12.7±0.2）%和（29.3±0.2）%，差異有顯著性（P＜0.05）；在72 h時，對HUVECs細胞的增殖抑制率分別為（12.6±0.7）%、（67.1±0.2）%和（95.8±1.2）%，差異有顯著性（P＜0.05）。

2.2 不同濃度5-Aza-CdR對HUVECs的遷移均有顯著性抑制作用

本實驗采用Transwell小室來觀察5-Aza-CdR對HUVECs遷移作用的影響。將不同濃度的5-Aza-CdR和HUVECs加入Transwell小室后培養24 h，再用甲醇固定并以結晶紫染色。結果顯示，溶媒對照組中大量HUVECs細胞可通過Transwell膜的孔隙遷移至膜的另一側，而在加入不同濃度5-Aza-CdR后，HUVECs遷移均被抑制，濃度為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L時的抑制率分別為12.8%，28.6%，59.4%。

2.3 各濃度5-Aza-CdR對管樣結構形成有明顯抑制作用

本實驗采用Matrigel膠模擬細胞外基質成分，觀察5-Aza-CdR對HUVECs管樣結構形成的影響。結果顯示，HUVECs細胞在Matrigel膠中能自主形成管樣結構，而不同濃度的5-Aza-CdR對管樣結構的形成均有明顯抑制作用。1μmol/L、5 μmol/L、10μmol/L的5-Aza-CdR對管樣結構形成的抑制率分別為19.3%、37.2%和74.6%。

2.4 5-Aza-CdR對VEGFR2表達的下調呈劑量依賴性

研究發現，以不同濃度的5-Aza-CdR處理HUVECs后，其對VEGFR2表達的下調呈劑量依賴性。

3 討論

3.1 5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs細胞增殖

腫瘤的發生、發展以及轉移與腫瘤細胞增殖和血管新生密切相關，血管生成首先是內皮細胞活化和增殖。本研究發現，5-Aza-CdR對 HUVECs的體外增殖具有明顯抑制作用，1 μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的5-Aza-CdR在24 h時對HUVECs細胞的增殖抑制率分別為（2.5±0.2）%、（12.7±0.2）%和（29.3±0.2）%；在72 h時對HUVECs細胞的增殖抑制率分別為（12.6±0.7）%、（67.1±0.2）%和（95.8±1.2）%，呈明顯的時間、劑量依賴性。說明5-Aza-CdR可能通過對血管內皮細胞增殖的抑制來阻礙血管生成，遏制腫瘤生長和轉移。

3.2 5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs細胞遷移

腫瘤新生毛細血管是在原有血管基礎上延伸擴展形成的，大量研究證實[8]，通過抑制內皮細胞遷移，能顯著抑制腫瘤新生毛細血管生長，從而抑制腫瘤發生、發展以及轉移。本研究利用Transwell小室觀察不同濃度5-Aza-CdR對HUVECs體外遷移的影響。結果顯示，1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的5-Aza-CdR在24 h時，對HUVECs遷移的抑制率分別為12.8%、28.6%和59.4%，提示5-Aza-CdR對血管生成過程中的HUVECs遷移可能也起著明顯抑制作用。

3.3 5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs細胞管樣結構形成

內皮細胞增殖、遷移以及形成微血管管腔是血管生成的晚期事件[9]。5-Aza-CdR在體外對血管內皮細胞的增殖、遷移均有明顯的抑制作用，為進一步探討其對內皮細胞管樣結構形成的作用，本研究觀察不同濃度5-Aza-CdR對HUVECs體外管腔形成的影響。結果顯示，HUVECs自8 h開始形成較多的管腔結構，24 h形成較為明顯的網狀結構，而加入5-Aza-CdR后網狀結構被顯著破壞。1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的5-Aza-CdR對管樣結構形成的抑制率分別為19.3%，37.2%和74.6%。提示5-Aza-CdR對管腔形成可能發揮較為顯著的抑制作用，從而抑制血管生成，使腫瘤細胞缺少營養供應，進而抑制其生長。

VEGF是目前已知的血管生成過程中最重要的血管生長因子之一，其通過與相應的3種受體結合，發揮各種生物學活性作用，對于3種受體研究最為廣泛的是特異性表達于內皮細胞的VEGFR2介導的信號轉導通路。VEGF通過與RTK受體VEGFR2相結合，使其二聚體化，并使受體自身發生磷酸化，導致下游蛋白（如ERK1/2、蛋白激酶C、AKT等）活化[10]，從而促進內皮細胞增殖、遷移以及管樣結構形成，進而使新血管生成[11]。因此，靶向抑制VEGF信號途徑是一個通過抑制腫瘤血管生成進而抑制腫瘤生長的可靠策略。本實驗采用Western Blot法檢測分析5-Aza-CdR對人臍靜脈內皮細胞VEGFR2表達的影響。結果表明，VEGFR2總蛋白的表達明顯下調。這可能是5-Aza-CdR抑制HUVECs增殖、遷移及管樣結構形成的機制之一。

綜上所述，5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs增殖、遷移和管樣結構形成，其機制可能與下調HUVECs細胞膜表面VEGFR2表達有關。提示可以通過5-Aza-CdR抑制腫瘤血管新生的途徑達到治療腫瘤的目的，為5-Aza-CdR在實體腫瘤治療中的應用提供理論依據。但基于體外實驗的局限性，仍需進一步行體內實驗研究來證實以上結論。

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