胃癌熒光分子成像診斷研究進展

賀 玲 綜述 劉海峰 審校

胃癌熒光分子成像診斷研究進展

賀 玲 綜述 劉海峰 審校

熒光分子成像；胃癌；探針

早期胃癌及癌前病變的篩查與檢測主要依賴白光內鏡觀察病變及活檢后的病理定性，而多數早癌形態變化不明顯，且病變活檢定位又缺乏準確性，漏診率很高[1]。隨著消化內鏡新技術的不斷發展,各種特殊內鏡，如窄譜成像內鏡(narrow band imaging，NBI)、智能分光比色技術(fuji intelligent chromo endoscopy，FICE)、放大內鏡、超聲內鏡等應用于臨床。這些技術通過強化病變部位黏膜表面構造、增強光學對比度，使病灶與正常黏膜的對比更加明顯。但目前仍缺乏大數據證明這些成像方式對病變檢出率優于高分辨率白光內鏡[2,3]。因此，我們亟需創新性的診斷篩查方式，熒光分子成像為我們提供了新的思路。

1 熒光分子成像的優勢

將熒光分子成像與消化內鏡融合形成的熒光內窺成像技術，利用熒光標記的探針在分子信號基礎上特異性使腫瘤病變發光，能在分子水平而非形態學水平識別和描述病變在體的黏膜特征[4,5]。在白光內鏡還未發現早期腫瘤病變時，分子標志物就能幫助區分正常黏膜和早期腫瘤病變，實現可疑病變的靶向性活檢,從而提高內鏡下病變的檢出率[6]，有望成為消化道早癌檢測技術的新突破。為什么選擇熒光分子成像與消化內鏡結合？首先，該成像方式具有快捷簡便、無輻射、可短期重復檢查、對腫瘤的成像靈敏度可達毫米級等優點[7]；其次，消化道為一天然暗箱，為熒光內窺成像提供了絕佳條件；另外，消化道腫瘤絕大部分起源于黏膜層，內窺成像模式完美地避開了熒光穿透性弱及空間分辨率低的缺點。要想實現熒光分子內窺成像在消化道早期癌診斷中的臨床轉化需從兩方面著手，第一，需要能夠與腫瘤病變特異性結合的探針使病變發光；第二，需要相應的熒光內窺設備來激發和捕捉病變部位發出的熒光。目前，胃癌的熒光分子成像依舊處于臨床前研究階段。本文主要圍繞胃癌熒光分子成像中的設備和靶向性熒光分子探針兩個方面進行綜述。

2 光學設備

在臨床應用中，熒光內鏡診斷病變的理想模式分宏觀和微觀兩步，黏膜表面噴灑或靜脈注射熒光探針后，先采用寬視場熒光內窺鏡快速篩選大片黏膜確定發光的可疑病變區域，接著利用熒光顯微內鏡進一步對發光病變放大定性，并在亞細胞水平可視化結合到各自靶點的分子探針[8]。目前，寬視場熒光內窺設備均是自制的實驗室原理樣機，還未實現商品化[9,10]。熒光顯微成像中有共聚焦激光顯微內鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)實現了商品化且已應用于臨床，CLE將熒光顯微成像整合到內鏡檢查中，利用熒光探針可獲得組織放大1000倍的光學顯微圖像，可在胃鏡操作中對黏膜進行細胞及亞細胞水平觀察，成像效果與病理HE染色(haematoxylin and eosin staining)有良好相關性[8]，有“光學活檢”的美譽。臨床所用CLE有兩種，一種是日本賓得(Pentax)公司的內鏡整合式CLE(endoscopeintegrated CLE，eCLE)，將微型共聚焦顯微鏡內置在白光內鏡頭端，可調節組織成像平面深度(表層至250 μm)，分辨率為7μm，拍攝速度1幀/s。另一種是法國莫納克亞公司(Mauna Kea Technologies)的探頭式CLE(probe based CLE，pCLE)，能夠通過消化內鏡的工作通道抵達黏膜，操作靈活，實用性好，成像速度較快(12幀/s)，實現了視頻記錄，但成像深度固定且成像視野較eCLE小。pCLE的迷你探頭有不同的外徑和分辨率，可與各種內鏡匹配，除了在腔體結構(食管、胃、結腸)，另在導管結構(膽管、胰管)、呼吸系統(肺、支氣管)、泌尿系統(尿道、膀胱)均有涉獵，更有細針型CLE(needle based CLE，nCLE)能通過19 G(0.91 mm)的穿刺針，可謂是無孔不入。兩種設備的激發光均為488nm，發射光波長505～585nm[8,11,12]。

3 靶向熒光分子探針

靶向熒光分子探針通常由信號組件和親和組件組成。信號組件指能產生熒光信號的標記部分(如有機熒光染料、量子點等)，親和組件也可稱為靶標，是與生物靶點特異性結合的部分(如抗體、短肽、核酸適體等)。生物靶點在病變細胞表面或細胞質過表達，比如胃癌特異性抗原(MG7、MGb2)[13,14]，細胞表面的一些特異性受體(如表皮生長因子受體[15]、肝細胞生長因子受體[16])等。分子靶點與光學活性探針作用后發出熒光信號，凸顯出腫瘤病變。根據靶標的不同，可將熒光分子探針劃分為抗體探針、短肽探針、適體探針、可激活探針[8]。

3.1 抗體探針 抗體提供了廣泛的靶標多樣性，與靶點有較高的親和力，是細胞外靶點或細胞表面受體的理想成像探針，其標記很好構建。另外，腫瘤分子靶向藥中治療性單克隆抗體更是一類有吸引力的靶標，在分子診斷成像同時還能指導腫瘤的靶向治療[17]。西妥昔單抗是臨床用于治療高表達表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)結直腸癌患者的分子靶向藥。2012年，Hoetker等[18]用熒光染料AlexaFlour488標記西妥昔單抗構建了靶向EGFR的熒光探針，經尾靜脈注射到裸鼠胃癌皮下移植瘤模型體內,利用CLE在荷瘤鼠瘤體上觀察到西妥昔單抗組熒光強度明顯高于對照組(P=0.047)，并在亞細胞水平定位了EGFR的分布。MG7抗原是解放軍第四軍醫大學課題組發現的一種特異性較高的胃癌相關抗原，在胃癌組織中表達率高達94%，在胃癌患者血清中的檢出率為83.6%，主要位于細胞膜、細胞漿和腺體，是極具早期診斷價值的胃癌分子標志物[13]。2013年，Li Z等[13]將AlexaFlour488標記的抗MG7單克隆抗體與新鮮人胃癌組織及正常胃組織體外共孵育后利用CLE檢測，結果顯示23例胃癌組織標本中22例有特異性熒光信號，而非癌組織標本則無或僅有弱熒光信號(P<0.001)。抗體作為探針仍有不足之處：分子量較大，擴散緩慢，到達目標結構的時間較長；有潛在的免疫原性；血清半衰期長，全身應用后易在體內積累，增加了背景噪音，降低了信噪比[17]。

3.2 短肽探針 相對抗體而言，短肽由少數氨基酸組成，具有分子量小、組織穿透力強、低免疫原性等優點，是另一類常用的靶向性熒光探針[19]。在過去的幾十年，從噬菌體展示肽庫(109)中篩選特異性靶向短肽配體有了大量研究。2013年，Xin J等[20]用新合成的對稱花青染料(CyIC)標記胃癌血管靶向肽GX1(該實驗室前期從隨機噬菌體肽庫中篩選出了與人胃癌血管內皮細胞特異性結合的環形九肽CGNSNPKSC[21])，構建了新型胃癌靶向熒光探針CyIC-GX1，小動物活體成像結果證明該探針對胃癌組織具有良好的靶向性，且細胞毒性低、光穩定性好。2015年Liu L等[22]從噬菌體隨機環七肽庫篩選出了能特異性識別胃癌組織血管內皮細胞的短肽CTKNSYLMC(GEBP11)，利用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記GEBP11，構建探針FITC-GEBP11，經人胃癌裸鼠皮下及原位移植瘤模型尾靜脈注射該探針后24 h進行CLE在體成像，結果顯示與對照組相比兩種小鼠模型瘤體處均有明顯的熒光信號(P<0.05)；將人胃癌組織與FITC-GEBP11孵育，離體組織CLE成像顯示28例胃癌標本中26例表現出不同強度的熒光。另有研究篩選出了靶向CD44的短肽RP-1，與肝細胞生長因子(c-Met蛋白)穩定結合的新型大環肽aML5-FL，并用熒光染料標記構建相應探針，成功完成了人胃癌細胞，人胃癌裸鼠皮下移植瘤的熒光分子成像[23,16]。雖大多數短肽探針沒有明確對應的生物靶點，但通過與靶細胞特異性結合的熒光檢測，完全可以進行疾病的診斷。

3.3 核酸適體探針 核酸適體是從隨機寡核苷酸文庫經體外指數富集配體系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選出的能特異性結合蛋白質或其他小分子物質的單鏈核苷酸片段(ssDNA或RNA)[24]。與短肽相似，因其分子量小，所以具有更加理想的藥代動力及組織分布特性，同時體外篩選成本低、周期短、易于合成修飾，與靶分子結合條件可控，靶標物質范圍廣泛(如有機小分子、蛋白質、病毒甚至細胞等)，是新一代理想探針之一[25]。對比短肽文庫，篩選適體的寡核苷酸文庫通常數目體積更大(1016)。上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)在許多固體腫瘤中過表達，在腫瘤診斷成像、預后、治療應用中是一個較為理想的靶點[26]。2013年，Song Y等[27]用SELEX技術得到了一組特異性識別EpCAM及EpCAM表達陽性細胞的ssDNA適體SYL3C。實驗結果證明，SYL3C能在多種細胞混合液中特異性識別表達EpCAM的腫瘤細胞，用FITC標記SYL3C與胃癌細胞孵育后，共聚焦熒光顯微鏡觀察到人胃癌細胞表面有較強的熒光。另一研究利用胃癌細胞AGS作為靶細胞，經cell-SELEX技術，從最終富集的ssDNA池得到一個胃癌細胞特異性DNA適體(cy-apt20)，經人胃癌荷瘤鼠模型尾靜脈注射熒光染料Cy5標記的cy-apt20 60min后，在腫瘤位點探測到的熒光強度約為對照組5倍，證實適體cy-apt20有作為胃癌靶向分子探針的潛力[28]。此外，還有科研團隊篩選出與HGC27細胞親和力和特異性最高的適體AGC03，將羧基熒光素(FAM)標記的AGC03與各種胃癌細胞、非胃癌細胞孵育。結果顯示AGC03同其他胃癌細胞系(BGC823, MGC803和SGC7901)也有結合能力，且親和力高，與起源于其他組織的腫瘤細胞(如肺癌、肝癌)無結合，該研究表明新興的適體探針對胃癌的臨床診斷和靶向治療有很好的促進作用[29]。

3.4 “智能”探針 與以上幾種活化探針相比，“智能”探針具有可激活的特點，它們開始為失活狀態，只有當特定的靶物質存在時才能被激活產生熒光信號，從而具有比其它探針更高的信號背景比[17]。其靶點多為腫瘤過表達的酶類，靶標為對應的底物。2012年，Ding S等[30]利用商業化的組織蛋白酶可激活探針ProSense?680和基質金屬蛋白酶可激活探針MMPSense?750FAST，對Smad4+/-裸鼠原位胃癌移植瘤模型進行在體熒光成像，在腫瘤感興趣區域探測到熒光強度分別是對照組的1.8倍和2.2倍。目前，“智能”探針文獻報道的種類較少，但這種具有創新性的“可激活”理念，能實現更佳的成像信噪比，相信未來科學家們定會致力于開發新型高效的熒光激活探針。

3.5 納米探針 為綜合多種分子影像技術的優點，基于納米探針的多模態成像應運而生,研究者對靶標進行多重標記后可利用不同成像方式檢測腫瘤病變。上海交大科研團隊證實乳腺癌相關抗原1(breast cancer related antigen 1，BRCAA1)約在65%的人胃癌組織中過表達，將其作為靶點成功構建了抗BRCAA1單抗耦合熒光磁性納米顆粒(FMNPs)的納米探針(抗BRCAA1-FMNPs)，完成了荷瘤鼠模型中胃癌組織(直徑約5 mm)的熒光/磁共振雙模態診斷成像[31]。另外，Wang P等[32]利用致密納米二氧化硅(dSiO2)包裹超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)形成殼-核納米顆粒，然后在殼外耦聯抗CD146單抗(YY146)和熒光染料800ZW構建了納米探針800ZW-SPION@dSiO2-YY146，實驗結果表明該納米探針與胃癌細胞的結合能力是對照組的14倍，經尾靜脈注射探針至胃癌皮下荷瘤鼠體內，利用小動物活體成像儀觀察，發現注射探針后30 min能觀察到瘤體的熒光，24 h達峰值，同時在瘤體部位能檢測強烈的磁共振信號。GEBP11作為靶向腫瘤血管內皮細胞的短肽，Su T等[33]利用其對胃癌組織的靶向特異性，構建了熒光/磁共振雙模態納米探針Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNP(CGD-MNP)，同樣體內熒光/磁共振成像顯示CGD-MNP在SGC-7901荷瘤鼠模型中成功可視化了腫瘤血管生成。基于雙模態的納米探針分子成像，集合了核磁共振成像高空間分辨率以及光學成像高靈敏度等優點，彼此取長補短，能夠更加精準的對病變進行診斷。除磁共振成像外，熒光成像還可以與正電子發射斷層掃描成像[34]、超聲成像等[35,36]其他成像方式結合應用，多模態分子成像從多角度、多維度觀察病變的生理過程，為臨床診斷提供更全面的影像學信息，會成為未來腫瘤分子診斷成像的一個重要方向。

雖然熒光分子成像在胃癌診斷中取得了大量臨床前研究成果，但要向臨床轉化，依舊任重道遠。應用于臨床的理想靶向探針應該毒性低、穩定性好、生物相容性好、特異性高、靈敏度高，并且適合大批量合成、生產[37]。然而，現階段的胃癌靶向性熒光分子探針離以上要求尚遠，故日后研發靶向性胃癌熒光分子探針時，不僅需要提高其靶向性，也需要應用多種新型材料、完善合成方法與檢測方法來合成滿足臨床需求的靶向性胃癌熒光探針。現今，食管和結腸病變的熒光分子成像已有人在體研究成果報道[38,39]。相信在不久的將來，胃癌熒光分子診斷技術也會有突破性進展。

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(2016-11-08收稿 2017-01-19修回)

(責任編輯 岳建華)

本刊“臨床病例討論”欄目征稿通知

為了貫徹“面向部隊，服務基層”的辦刊宗旨，加強不同層次醫療機構臨床實踐交流，幫助基層醫師學習和了解先進教學醫院和知名專家對疾病的臨床診治思路,提高基層衛生機構的臨床業務水平。本刊于2012年開辟“臨床病例討論”欄目。報道武警部隊各級醫院及重點學科臨床工作中遇到的疑難和典型病例，以及基層衛生隊經過多學科專家遠程會診得以成功治療的典型病例。

1.病例選擇： (1)選擇的病例要具有代表性且不涉及醫院敏感問題，優先錄取多學科交叉病例；(2) 診斷明確，但病情危重、治療棘手的病例；(3) 罕見病例。以上病例須最終獲得明確診斷或成功治療，臨床資料應齊全，能提供實驗室、影像學和病理確診依據。

2.寫作格式： 正文分“病例介紹”和“臨床討論”兩部分。病例介紹：交代清楚患者主訴、病史(包括既往史)，實驗室、影像學及病理學檢查結果、臨床診斷、治療方案、治療結果等(需要提供影像學檢查的圖片)。臨床討論：為主體內容，首先提出目前病例診斷治療的進展和需要解決的問題等討論要點；之后由參加會診的知名專家點評，寫清診斷和治療思路、鑒別診斷要點、治療上應注意的問題等，為今后的臨床工作提供借鑒和參考。若為罕見病，則介紹目前國內外的最新進展。會診專家需署名(如無外請專家，也可署本院科主任名)，格式如：張某某醫師(肝膽科)。具體行文格式參考本欄目已發表的論文格式。全文字數3800或6500左右。

來稿請在右上角標注“臨床病例討論”。本欄目所錄稿件為原創性臨床研究論文，歡迎廣大臨床醫師踴躍投稿！

武警醫學編輯部

2017年1月

國家自然科學基金項目(81471700)

賀 玲，碩士研究生。

100039 北京，武警總醫院消化內科

劉海峰，E-mail:haifengliu333@163.com

R753.2