青鵬膏劑穴位貼敷對肥大細胞數量及 脫顆粒的影響*

安 娜 屈敬陽 劉丁丁 楊志新(承德 067000)

河北省中藥研究與開發重點實驗室 承德醫學院中藥研究所

青鵬膏劑穴位貼敷對肥大細胞數量及 脫顆粒的影響*

安 娜 屈敬陽 劉丁丁△楊志新△△(承德 067000)

河北省中藥研究與開發重點實驗室 承德醫學院中藥研究所

目的：觀察體表穴區貼敷青鵬膏劑后，大鼠穴區內肥大細胞(MCs)的分布以及數量和脫顆粒的變化，了解穴位貼敷對皮膚組織的影響，研究其發揮作用的可能性機理。方法:健康Wistar大鼠30只,隨機分為空白對照組(A組)、電針組(B組)和青鵬膏劑貼敷組(C組)，每組10只。干預組動物給予青鵬膏劑貼敷或電針刺激7d后, 分別取3組動物的“大椎”穴區皮膚組織塊做冰凍切片，經亞鐵氯化銅法示乙酰膽堿酯酶并甲苯胺蘭復染，比較3組“大椎”穴區組織MCs分布、數量及脫顆粒的差異，研究穴區內MCs的形態學改變。結果: 各組“大椎”穴區真皮、皮下組織和肌肉組織中都分布著大小、數量不等的MCs，以皮下組織層分布最為廣泛，多沿神經或血管分布。與A組比較，青鵬膏劑貼敷組穴區組織局部MCs數量及脫顆粒率顯著升高，差異有顯著性(P<0.05)。結論:青鵬膏劑穴位貼敷能夠明顯引起皮膚組織內MCs數量增多及脫顆粒，有促聚集作用，是穴位貼敷與經絡、藥物協同增效的可能性因素之一。

青鵬膏劑；穴位貼敷；肥大細胞；脫顆粒；電針；大椎穴

穴位貼敷療法，[1]最早見于《五十二病方》，是以中醫整體觀念理論為指導，依據經絡學說，應用中藥作用于腧穴，繼而通過經絡作用于肌體，從而達到疏通氣血、調整陰陽的作用。其特點是操作作簡便、用藥安全、經濟廉價。青鵬膏劑為藏藥經典方劑，是由選自于青藏高原的傳統藏藥亞大黃、鐵棒錘、棘豆、訶子、毛訶子、人工麝香、安息香等9味組成，經特殊工藝加工而成的外用膏劑，[2]具有活血祛瘀、瀉火解毒、除風濕止痹痛等功效。[3]本實驗擬以青鵬膏劑穴位貼敷對皮膚組織內肥大細胞(MCs)的影響為切入點，研究穴位貼敷療法發揮療效是否與皮膚組織結構的變化相關。

1 材料

1.1 實驗動物 健康Wsitar大鼠30只，體質量230～240g，雌雄不拘，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔實驗動物質量合格證號:scxk(京)2012-0001〕。實驗中，對動物處置完全遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 藥物、儀器與試劑 青鵬膏劑(由亞大黃、鐵棒錘、棘豆等9味藏藥運用藏藥理論配伍，經過煮沸、提取、濃縮等步驟制成的軟膏，購自西藏林芝奇正藏藥廠, 國藥準字Z54020140)；電針治療儀G6805-Ⅱ型(青島鑫升實業有限公司)，恒冷箱切片機(英國ThermoFisherScientific公司)；硫代乙酰膽堿(日本TCI公司)，甲苯胺藍(TolurdineBlueO)(美國Amresco公司)。

2 方法

2.1 分組及處理方法 30只大鼠隨機分為空白對照組(A組)、電針組(B組)和青鵬膏劑貼敷組(C組)，每組10只。 空白對照組：于實驗中不做干預，不給予其它任何刺激；電針組：將大鼠固定后，根據《實驗針灸學》(郭義主編，中國中醫藥出版社，2008)大鼠常用針灸穴位，選大椎穴，采用電針法，用毫針針刺，得氣后針柄接電針治療儀G6805-Ⅱ型，刺激參數為：2/15Hz，1mA，每次電針時間20min，1次/d；青鵬膏劑組：將青鵬膏劑均勻涂敷于以大椎穴為中心, 直徑為1.5cm的區域內，25mg/次，2次/d(上午8點及下午4點)。干預結束后，給予大鼠標準育成飼養過夜。在開始后的7d內進行實驗干預，完成干預后取材。

2.2 取材與染色 取大鼠“大椎”穴區皮下組織塊(包括皮膚、皮下結締組織和少量肌肉組織, 大小約(1×1×0.5cm)，用錫箔紙包好后放入凍存管中，編號，放入-80℃冰箱中保存。用恒冷箱切片機切片，厚度約15μm。后經乙酰膽堿酯酶組化染色加甲苯胺藍復染組織切片，[4]常規酒精脫水(脫水時間不宜過長，每級10～30s,依據顯微鏡下MCs顏色深淺調整脫水時限)，二甲苯透明4min左右，中性樹膠封片。

2.3 觀察MCs分布，對MCs計數及計算脫顆粒率 在光學顯微鏡下觀察穴區皮膚組織內MCs的分布和形態特征。每只大鼠觀察“大椎”穴區深層皮下組織4張切片, 每張切片觀察3個視野(100倍), 分別計數MCs數量及脫顆粒數, 用脫顆粒率計算公式(脫顆粒率=脫顆粒細胞數/MCs數量)，求得每張切片MCs的脫顆粒率。取平均值作為該穴區組織的脫顆粒率。

3 結果

3.1 各組穴區內MCs分布規律及計數統計 本實驗的組織切片形態學觀察顯示：各組“大椎”穴區真皮、皮下組織和肌肉組織中都分布著大小、數量不等的MCs，多成條帶狀分布，以皮下組織層分布最為廣泛。如圖1所示：MCs多呈圓形、卵圓形,胞質內充滿異染性藍色顆粒，多沿神經或血管等分布，且青鵬膏劑貼敷組與電針組MCs數量明顯多于空白組。如圖2所示；數據統計表明：與A組相比，其他2組穴區組織局部MCs數量顯著升高，差異顯著(P<0.01)。B、C組做組間比較，差異無顯著性(P> 0.05)如表1所示。

圖1 大鼠“大椎”穴區MCs在真皮、皮下、 肌肉分布情況(×100)

注：青鵬膏劑貼敷組:1 真皮層，2 皮下組織層，3 肌肉組織層。黑色箭頭所指為MCs

3.2 各組“大椎”穴區MCs脫顆粒率的比較 表1顯示，各組穴區MCs脫顆粒率分析比較為青鵬膏劑組> 電針組> 空白對照組。其中，青鵬膏劑組與空白對照組差異具有非常顯著性(P< 0.01)；電針組與空白對照組組間差異具有非常顯著性(P< 0. 01)，電針組與青鵬膏劑組差異無顯著性(P> 0.05)。

圖2 各組大鼠“大椎”穴區皮下組織 MCs分布情況(×100)

注：A.空白組，B.電針組，C.青鵬膏劑貼敷組;黑色箭頭所指為MCs；紅色箭頭所指為血管；綠色箭頭指為神經。

組別例數MCs計數(個)MCs脫顆粒率(%)A組1026.87±0.41 29.91±1.42 B組1036.04±1.53*57.48±1.63*C組1038.17±1.46*62.49±0.05*

注：與A組比較，*P<0.01

4 討論

依據經絡學說：經絡是人體內運載氣血的通道，能夠溝通表里內外，聯系五臟六腑。穴位貼敷療法，是將中藥涂敷于體表腧穴，透過皮膚、腧穴，經絡，達到治愈疾病的目的，實質在于經絡、穴位與藥物的有機融合。[5]現代研究發現，藥物作用于腧穴后，該穴區的組織結構、皮膚、神經、血管等均發生變化，進而在相應組織器官產生藥理效應，起到治療作用” 。[6]這可能是藥物顯效的可能性機理之一。目前關于中藥穴位貼敷經皮給藥的機制研究報道尚少。

經穴組織內MCs的分布、數量、脫顆粒及在循經感傳現象中的作用機制是目前國內外學者關注研究的熱點之一。近20年來的研究證明,人體經絡穴位的物質基礎是以結締組織為基礎,尤與MCs關系密切。[7]羅氏等[4，8-10]研究發現電針針刺穴位能引起MCs數量的變化及其脫顆粒的發生以及通過電針刺激，MCs與神經、血管構成接觸聯系,且青鵬膏劑貼敷裸鼠穴區也能引起MCs數量增多及血管擴張。本實驗比較電針與穴位貼敷兩種中醫傳統治療方法在引起MCs形態學方面的變化。二者沒有顯著差異，有待進一步研究。

本實驗觀察到青鵬膏劑組貼敷“大椎”穴區后，皮膚組織MCs數量及脫顆粒數量, 均明顯多于對照組, 統計學處理結果顯示二者間差異有顯著性,說明穴位貼敷可使MCs向穴位遷移,以及引起MCs的脫顆粒變化。這提示青鵬膏劑穴位貼敷的藥效作用與MCs參與密切相關。可能是通過脫顆粒釋放活性物質發揮調節肌體、治愈疾病的作用，這將是筆者下一步深入研究的方向和課題。

[1]吳桂華，孫通華，崔艷霞，等.穴位貼敷的臨床實驗研究概況[J].中國中醫藥現代遠程教育，2010，8(12)：265-266

[2]鄭福榮.奇正青鵬膏劑外敷配合按摩治療網球肘56例報告[J].臨床醫藥實踐,2010,19(6B): 699-700

[3]王春萍,石義華.奇正青鵬軟膏外用治療七葉皂苷鈉所致靜脈炎療效觀察[J].護理學雜志,2015,30(3):37-38

[4]羅明富,宋曉晶.報告一種同時顯示肥大細胞、血管、神經等組織成分的新染色方法[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2012,21(5):499-500

[5]謝洋，余學慶.試述穴位貼敷的作用機理及其臨床運用[J] .中國醫藥指南，2008,6(24) :320-322

[6]劉強,周莉玲,李銳.中藥透皮吸收制劑的研究思路[J] .中藥新藥與臨床藥理,1997,8(2)：116-118

[7]張迪,丁光宏,沈雪勇,等.經絡穴位與肥大細胞相關性研究進展[J].針刺研究,2005,30(2):115-116

[8]羅明富,何俊娜,郭瑩,等. 電針和懸灸對“大椎”穴區肥大細胞脫顆粒不同影響的研究[J] .針刺研究,2009,32(5):327-329

[9]張金鈴,羅明富,崔山佳.肥大細胞在經穴組織內的分布與脫顆粒觀察[J].解剖科學進展,2010,16(1):36-38

[10]羅明富,崔山佳,張金鈴.新鮮組織肥大細胞快速染色方法的探討與應用[J] .中國組織化學與細胞化學雜志,2010,19(1):108-109

[11]羅明富,李翠紅,張棟,等.青鵬膏劑穴位貼敷裸鼠穴區對皮膚內血管和肥大細胞的影響[J].中國中藥雜志,2008,33(7):816-818

(2016-08-06 收稿)

Effect of Acupoint Application withQingpengPasteon Mast Cells Numbers and Degranulation Hebei Key Lab of TCM Research and Development, Institute of Chinese Materia Medica of Chengde Medical College

ANNaQUJing-yangLIUDing-dingYANGZhi-xin

(Chengde 067000)

Objective: to observe the distribution and number of mast cells and the degranulation after the acupoint application withQingpengPaste,tounderstandtheeffectoftheapplicationtherapyandtoexploreitspossibilitymechanism.Methods: 30healthyWistarratswererandomlydividedintocontrolgroup(GroupA),electroacupuncturegroup(GroupB)andapplicationgroup(GroupC).GroupBandCweregivenapplicationorelectroacupuncturefor7daysbeforetheskinpiecesaroundDazhui(GV14)ofthethreegroupsweretakenforcryosections,thenferrouscopperchloridemethodwasusedtoshowAcCHE(acetylcholineesterase)andaftertoluidinebluecounterstaining,compareMCsdistributions,numbersanddegranulationsbetweeneachgroup,andresearchthemorphologicalchangesofMCsinacupointareas.Results:MCsofdifferentsizesandnumbersweredistributedindermis,hypodermisandmuscletissuesofDazhuiarea,mostextensivelyinhypodermisalongnervesorvessels.ComparedwithGroupA,localMCsnumberanddegranulationrateofGroupCwereincreasedwithsignificantdifference(P<0.05).Conclusion:acupointapplicationwithQingpengPastecanincreaseMCsnumberanddegranulation,promotetheaggregationofMCs,whichisoneofthepossibilityfactorsofapplication,meridiananddrugssynergy.

QingpengPaste;acupointapplication;MCs(mastcells);degranulation;electroacupuncture;Dazhui(GV14)

*河北省自然科學基金項目：No.H2014406047；河北省高等學校科學技術研究重點項目：No.ZD20131001

楊志新，女，教授，醫學博士，博士研究生導師。

R

A

1007-5615(2017)01-0006-03

△ 華北理工大學中醫學院(唐山063000)

△△ 承德醫學院中醫學院(承德067000)