102例肺腺癌常見基因突變與中醫證型關系的研究?

王 君，徐 力

(南京中醫藥大學 第一臨床醫學院， 南京 210023)

肺癌作為全球癌癥的第一大殺手，嚴重影響患者的健康及生存質量，肺癌同樣居我國癌癥發病率首位，其中肺腺癌占非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的50%左右。肺腺癌作為非小細胞肺癌中的重要亞型,其分子分型對指導預后判斷及個體化治療具有重要意義，其中較為常見的為表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、Kirsten鼠肉瘤病毒基因(Kirsten rat sarcoma,KRAS)、棘皮動物微管相關類蛋白4(echinoderm microtubule associated protein like4, EML4) 與間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK) 融合基因 EML4-ALK。雖有大量研究文獻對肺腺癌的中醫證型進行報道，但肺腺癌的基因變異類型與中醫證型之間關聯性的研究甚少。本文就二者的相關性進行探討，為從分子機制角度更深層次地認識肺腺癌的中醫證型本質提供參考。

1 臨床資料

1.1 納入和排除標準

經病理學或細胞學確診的原發性肺腺癌；已行上述基因檢測的肺腺癌患者；已確診有上述基因變異之一的肺腺癌患者；年齡大于18歲；未經任何治療的原始初診患者。排除標準：非上述3種單基因突變患者；合并其他腫瘤的患者；嚴重心肝腎疾病和功能障礙患者。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 患者臨床病理類型及分期采用《中國原發性肺癌診療規范(2015版)》[1]與《NCCN肺癌篩查指南(2016V2)》標準；通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)及DNA直接測序法檢測EGFR外顯子18-21突變類型、KRAS 外顯子2、3突變類型，熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測EML4-ALK融合基因。

1.3.2 中醫證型辨證標準 本研究參考《中藥新藥治療原發性支氣管肺癌臨床指導原則》(試行)[2]，以及收集患者癥狀表現，經組內探討分析后，決定把肺腺癌患者中醫證型分為5型，氣虛痰濕證：胸悶氣短，咳嗽，咳白色黏稠痰，納呆便溏，苔白膩，脈弦滑;陰虛內熱證：咳嗽少痰，心煩口干，胸痛氣急，潮熱盜汗，舌紅少津，脈細數；氣陰兩虛證：咳嗽少痰，痰稀而黏，咳聲低微，氣短喘促，神疲乏力，心煩盜汗，口干少飲，舌紅苔薄白或薄黃，脈細弱；氣滯血瘀證：咳嗽咯痰不爽,咳嗽帶血,胸悶胸痛如刺,痛有定處,大便秘結,唇甲紫暗,舌質暗或瘀斑；熱毒熾盛證：咳嗽、咳黃色黏稠痰，胸痛，口干鼻燥，口渴欲飲，發熱，脈數，苔黃。

1.4 資料來源

收集2016年5月至2016年11月在南京止馬營等8個社區240例肺癌患者病例資料，所有患者的石蠟包埋組織標本切片均經蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE染色法)，并經江蘇省中醫院病理科診斷確診為肺腺癌，其中符合納入標準患者為102例，女性52例，男性50例，平均年齡(58±8.3)歲，年齡范圍為37～78歲。根據TNM分期Ⅰ期患者23例,Ⅱ期28例,Ⅲ期27例,Ⅳ期24例。

2 研究方法

2.1 基因檢測方法

2.1.1 試劑及設備 DNA提取試劑盒DEXPAT、Taq酶購自寶生物工程(大連)有限公司，基因擴增PCR儀為美國ABI 9700，DNA測序儀為美國ABI 3730xl，ALK雙色分離探針試劑盒購自北京金菩嘉醫療科技有限公司，熒光顯微鏡為日本Olympus BX51產品。

2.1.2 DNA提取及定量 用二甲苯脫蠟及無水乙醇脫水處理患者石蠟包埋組織切片，采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，所有步驟按照試劑說明書操作，將3～5片10 μm的切片置于Eppendorf管中，加10滴DNA抽提液充分混勻，100 ℃下加熱10 min，13000 r/pm離心10 min，DNA提取后使用紫外分光度計檢測濃度，然后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA質量。

2.1.3 EGFR、KRAS突變檢測 表1顯示，使用PCR及DNA測序法檢測EGFR基因18～21號外顯子突變以及KRAS 2、3號外顯子突變。引物設計及合成：EGFR 18-21外顯子與KRAS 外顯子2、3外顯子引物序列均由上海生工生物工程有限公司設計合成。PCR反應條件: 94 ℃，5 min(95 ℃，30 s，60 ℃，45 s， 72 ℃，60 s)×40 個循環；72 ℃，10 min；PCR 反應體系：10×buffer，dNTP mix，MgCl2，正向引物25pmol，反向引物25 pmol，Platinum Taq 酶和 DNA 模版50ng。所有PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖電泳后送至南京世和基因生物有限公司進行測序。運用CIROMAS軟件分析結果，并與基因庫中正常EGFR基因序列和正常KRAS序列進行比較。

2.1.4 EML4-ALK融合基因檢測 使用ALK雙色分離探針試劑盒進行檢測，探針區域在2p21～2p23。根據試劑盒說明書進行操作，具體步驟：4～5μm石蠟切片56℃烤片3 min，常規脫蠟，滴加胃蛋白酶預處理液消化15 min； 2×SSC漂洗5 min固定，每個切片滴加ALK探針10 μL，覆蓋雜交蓋片78 ℃變性8 min，保持42℃雜交過夜，雜交后先浸入0.4×SSC/0.3%NP-40洗滌液洗滌1.5 min， 后浸入2×SSC/0.1%NP-40洗滌液洗滌0.5 min，再使用70%乙醇洗滌5 min，干燥后加入適量DAPI復染劑至雜交區域，用熒光顯微鏡觀察。結果判讀：ALK陽性標準：任何著色細胞內存在細胞胞質內有強染色顆粒即可判定為陽性。ALK重排為腫瘤細胞胞質內紅色和綠色信號分離，間距≥2個信號直徑或單一紅色信號。ALK無重排為腫瘤細胞內紅色和綠色信號黏合或出現黃色信號。FISH 陽性檢測標準: ALK陽性是計數為50個觀察細胞中存在>25陽性細胞，即可直接判定為ALK陽性，若存在5～25個陽性細胞需再計數50個腫瘤細胞，100個觀察細胞總存在≥15個陽性細胞，可判定為ALK陽性。

表1 EGFR與KRAS基因擴增引物

2.2 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，中醫證型、基因突變類型采用構成比，病期與中醫證型相關性、基因變異與中醫證型相關性采用卡方檢驗，P<0.05，P<0.01為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 基因檢測結果

3.1.1 EGFR、KRAS的PCR法檢測結果 圖1、2顯示，在送檢的102例肺腺癌石蠟包埋切片中，EGFR突變共73例，共發生在外顯子19(38例)、20(23例)、21(12例)，18無外顯子突變。外顯子19突變共包括del-E746-A750缺失突變(32例)和del-L747-P753insS突變(6例)。外顯子20突變是T790 M突變，外顯子21是 L858R突變，KRAS 突變有12例,其中均是2外顯子G12C突變。

3.1.2 EML4-ALK融合基因FISH檢測結果 圖3顯示，在送檢的102例肺腺癌石蠟包埋切片中，ALK雙色分離探針試劑共檢出14 例強陽性，3例可疑陽性，85例陰性。

圖1 EGFR 擴增產物電泳條帶注：Lane1：外顯子18(394 bp)；Lane2：外顯子19(394 bp)；Lane3：外顯子20(283 bp)；Lane4：外顯子21(297 bp)； M:maker

圖2 KRAS擴增產物電泳條帶注：Lane1：外顯子2(353 bp)；Lane2：外顯子3(294 bp)；M:maker

圖3 雙色分離 FISH 探針檢測 EML4-ALK 融合基因注：ALK陽性肺腺癌患者FISH檢測出腫瘤細胞胞質出現紅綠信號分離或者額外的紅色信號(箭頭示)，提示存在EML4-ALK 融合基因

3.2 統計結果

3.2.1 102例肺腺癌中醫證型構成 表1顯示，肺腺癌下各中醫證型之間比較差異有統計學意義(χ2=18.294,P=0.001<0.01)，其中肺腺癌以氣陰兩虛表現為主。

表1 102例肺腺癌中醫證型構成比較[例(%)]

3.2.2 102例肺腺癌基因突變類型構成 表2顯示，肺腺癌下各基因突變類型之間比較差異有統計學意義(χ2=88.065，P=0.000<0.01)，其中以EGFR突變型為主。

3.2.3 102例肺腺癌中醫證型與基因變異之間相關性比較 表3顯示，各組3種基因突變之間經統計學比較,EGFR基因突變下肺腺癌中醫證型之間比較差異有統計學意義(χ2=31.863，P=0.000<0.05)，其中以氣陰兩虛證表達為主；EML4-ALK突變下與KRAS突變下證型比較差異無統計學意義(χ2=4.471，P=0.346>0.05，χ2=6.333，P=0.176>0.05)；3種基因突變下的證型之間比較差異有統計學意義(χ2=20.666，P=0.008<0.05)；兩兩比較，EGFR與EML4-ALK變異下證型比較差異有統計學意義(χ2=11.546，P=0.021<0.05)，EGFR與KRAS基因突變組間中醫證型比較差異有統計學意義(χ2=11.869，P=0.018<0.05)，EML4-ALK與KRAS基因突變組間中醫證型比較差異無統計學意義(χ2=1.212，P=0.876>0.05)。

表2 102例肺腺癌基因突變類型構成比較[例(%)]

表3 102例肺腺癌中醫證型與基因變異之間相關性比較(%)

3.2.4 102例肺腺癌中醫證型與臨床分期相關性比較 表4顯示，經卡方檢驗后各分期之間中醫證型比較差異有統計學意義(χ2=61.101，P=0.000<0.05)，其中氣陰兩虛證以Ⅲ期、Ⅳ期為主。

表4 102例肺腺癌中醫證型與臨床分期之間相關性比較[例(%)]

4 討論

中醫認為肺癌發病機制以正虛為本，首先是正氣不足，無力抵御毒邪導致毒瘤內生[3]；其次臟腑受損，氣血津液運行不暢，外邪侵襲，癌毒內生，導致疾病的發生。本研究Ⅰ、Ⅱ期患者以氣滯血瘀證和氣虛痰濕證為主，Ⅲ、Ⅳ期患者以氣陰兩虛證為主，肺癌患者早期邪實正不虛、正邪相爭表現為實證。又因本研究入組患者多居南方，天氣潮濕，濕邪困脾，久生痰濕，氣虛導致氣血運行不暢久致血瘀，故常表現為氣滯血瘀證和氣虛痰濕證，疾病由淺及深，機體無力抵抗外邪，病證由實至虛，中晚期多表現為虛證。《周氏醫學叢書·臟腑標本藥式》[4]指出：“肺藏魄，屬金，總攝一身之氣。”肺主氣，肺臟受損呼吸功能定會受到損失，不僅影響宗氣的生成，也影響一身之氣的盛衰，易導致氣虛，故肺癌患者常常表現為氣短、乏力等癥狀。肺為嬌臟，喜潤惡燥，邪熱耗津常表現為肺陰不足。肺癌發病以正虛為本，其中常見氣陰兩虛，中晚期患者因病情發展，或因化放療等各種治療手段導致惡心嘔吐等消化道反應，更易耗氣傷陰。本研究可知，肺腺癌中EGFR突變型較為常見，EGFR基因突變下肺腺癌中醫證型之間比較差異有統計學意義，其中以氣陰兩虛證表達為主，中晚期肺腺癌患者也常表現為氣陰兩虛證的虛證。

EGFR是上皮生長因子(EGVF)細胞增殖和信號傳導受體，能與表皮細胞生長因子(EGF)及 轉化生長因子-α(TGF-α)有效結合，從而激活受體酪氨酸激酶,使受體本身及細胞內酪氨酸殘基磷酸化, 從而引起細胞的異常分裂增殖[5]。在EGFR基因調節作用失控情況下[6]，通過相應的信號通路，調控腫瘤細胞的惡性增殖、周圍血管生成、腫瘤侵襲轉移。中晚期以虛證為主兼并實證，氣虛使血行不暢，陰虛使邪熱內生、津液損耗，機體內環境發生改變。如血液高黏狀態、免疫調節功能受損，促進腫瘤亢進的生長因子，破壞因子間的平衡，促使腫瘤細胞與基質成分的黏附、腫瘤血管的生長以及增強腫瘤細胞相關信號通路，更加增強了EGFR基因及相關基因的高表達，導致腫瘤細胞的增殖，故肺腺癌EGFR基因突變型治療應重視補肺養陰和益氣健脾。

既往研究可知，益氣養陰法可以抑制腫瘤的增殖、侵襲、轉移。胡小勤[7]認為益氣養陰方生脈散能夠降低人工基底膜種植體內的內皮細胞遷移數，起到抗肺癌腫瘤細胞血管生成的作用。李春杰[8]發現，益氣養陰組方(黃芪、白術、天冬、茯苓、白花蛇舌草等) 能夠明顯降低C57BL/6小鼠 Lewis 肺癌中金屬角蛋白酶-9(MMP-9)及其抑制物(TIMP-1)水平，抑制肺癌的轉移。肺積方[9]能促進腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌，抑制 EGFR表達，從而抑制Lewis肺癌腫瘤細胞增殖與轉移。鄒銀水[10]認為，益氣養陰方可以顯著改善氣陰兩虛證患者的生存質量及免疫功能。然而本研究由于納入樣本量偏小，此結論仍需大樣本、多中心研究證實。

綜上所述，肺腺癌的EGFR突變型患者以氣陰兩虛為主，且益氣養陰法可以抑制腫瘤細胞的增殖轉移，提示基因突變檢測結果有望成為未來中醫藥辨證治療肺癌的參考指標之一，對闡明中醫藥辨證肺癌的機制具有重要的科學價值。

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