左歸降糖解郁方對糖尿病并發抑郁癥大鼠HPA軸及海馬糖皮質激素受體表達的影響?

韓遠山，趙洪慶，楊 蕙，杜 青，孟 盼，柳 卓，王宇紅△

(1. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007； 2. 湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，長沙 410208)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，影響著全球3.82億人的生活[1]。糖尿病患者易產生多種并發癥，其中糖尿病并發抑郁癥(diabetes mellitus with depression, DD)是導致患者自殺率最高的慢性并發癥之一[2]。據報道，DD患者自殺的可能性高達10%，遠遠大于普通人群的0.01%～0.03%[3]。因此，開展DD發病機制研究并進行藥物防治具有重要意義。

研究表明，糖尿病和抑郁癥患者都存在顯著的神經內分泌改變，表現為下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能亢進，即HPA軸分泌的表現為腎上腺分泌的糖皮質激素代謝紊亂，在海馬、下丘腦等部位與其受體結合，介導HPA軸負反饋功能障礙[3]。海馬組織作為最易受2型糖尿病高血糖影響的腦內組織，對糖皮質激素的過度表達異常敏感，糖皮質激素代謝紊亂可能是DD發生的重要原因[4]。然而，DD狀態下HPA軸是否依然存在亢進現象，糖皮質激素及其受體(glucocorticoid receptor, GR)在關鍵靶部位海馬中是否會有明顯改變，均未見有相關研究。因此，本研究以HPA經典指標及海馬GR表達為切入點，探討左歸降糖解郁方對DD大鼠海馬組織的保護作用是否與調節HPA軸及糖皮質激素受體有關，對DD的發病機制研究及其臨床防治都具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 藥物

左歸降糖解郁方由貫葉連翹、姜黃、熟地黃、黃芪、菟絲子等藥物組成，原藥材購買于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。二甲雙胍購自湖南湘雅制藥有限公司(0.25 g/片×20片，批號1402115),氟西汀購自禮來蘇州制藥有限公司(20 mg/粒×28粒，批號2087 A)。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠75只，體質量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物公司[SCXK(湘)2013-0004]，飼養于湖南中醫附一院SPF級實驗動物中心[SYXK(湘)2015-0003]。購入大鼠后先適應性喂養3 d，期間自由飲水攝食。

1.3 試劑

促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropin releasing hormone, CRH)、促腎上腺皮質激素(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮質酮(Corticosterone, CORT)試劑盒均購自美國R&D公司,STZ購自美國Sigma公司,兔抗鼠GR一抗購自英國Abcam公司,RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Thermo公司,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德公司。

1.4 主要儀器

血糖測量儀、血糖試紙(Johnson)；MK3型酶標儀(Thermo)，5417R低溫高速離心機(Eppendorf)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)，手動輪轉式切片機(Leica)，電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 大鼠分組及模型制備

75只SD大鼠中取10只作為正常對照組，剩余大鼠全部用于制備糖尿病模型。采用高脂灌胃聯合尾靜脈注射STZ(38 mg/kg)建立糖尿病模型，于STZ注射72 h后測定所有大鼠空腹血糖值。根據血糖測定結果，選取≥16.00 mmol/L的大鼠作為糖尿病模型大鼠，并將其隨機分為模型組、左歸降糖解郁方高、中、低劑量組和陽性藥組。分組完成后，繼續給予模型大鼠慢性不可預見性應激(CUMS)，應激方法主要包括禁食或禁水24 h、冰水浴4 min、噪音4 h、50 V電擊3 min、光照或黑暗24 h、傾籠24 h、夾尾1 min、潮濕墊料24 h，每天隨機采用1～2種刺激，持續28 d，在抑郁造模期間所有大鼠均采用單籠飼養方法。

2.2 給藥

所有大鼠均在抑郁造模的同時給予灌胃給藥，其中左歸降糖解郁方高、中、低劑量對應藥物濃度分別為32.82、16.41、8.20 g/kg，陽性藥為臨床一線降糖藥二甲雙胍和抗抑郁藥氟西汀，對應濃度分別為0.18 g/kg、1.8 mg/kg，正常組和模型組則分別給予蒸餾水，給藥體積均為10。末次給藥結束后1 h，對所有大鼠進行血糖值、行為學測定，測試完成后采用水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，抗凝管中收集大鼠血漿，并取腦、海馬組織保存待用。

2.3 空腹血糖值測定

于測定前禁食6 h，采用剪尾取血法剪取大鼠尾根部動脈血，血糖儀測定各組大鼠的空腹血糖值。

2.4 強迫游泳實驗

參照課題組前期發表的強迫游泳實驗方法進行檢測[5]。

2.5 HE染色

取固定于4%甲醛溶液中的腦組織，常規石蠟包埋后切片，經蘇木精-伊紅染色(HE染色)后顯微鏡下觀察、拍片，分析各組大鼠腦內海馬組織的病理損傷情況。

2.6 ELISA檢測

采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血漿HPA軸指標CRH、ACTH、CORT的含量，整個操作過程嚴格按照說明書進行。

2.7 Western-blotting實驗

取冷凍保存的海馬組織，按每mg組織5ul比例加入RIPA裂解液，冰上勻漿、4 ℃12000 r/min離心15 min后,取上清液制備組織蛋白提取液，BCA試劑盒測定蛋白含量。按照Western-blotting實驗方法檢測大鼠海馬組織中GR蛋白表達量，采用ImageJ圖像分析軟件掃描各條帶，以目的蛋白和內參蛋白對應灰度值的比值,作為蛋白的相對表達水平。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 血糖值及行為學測試結果

表1顯示，與正常組比較，DD模型組大鼠血糖值顯著升高，強迫游泳測試不動時間顯著增加(P<0.01)。與模型組大鼠比較，左歸降糖解郁方高、中劑量組大鼠血糖值均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，高劑量組大鼠的不動時間顯著降低(P<0.05)。

3.2 HE染色結果

圖1顯示，正常組大鼠海馬神經元形態規則，排列整齊，神經元間隙正常。模型組大鼠海馬神經元胞體腫脹，核固縮，胞漿濃縮深染，呈一定的空泡狀，神經元之間排列紊亂無序，間隙拉長。陽性藥和左歸降糖解郁方高劑量組大鼠海馬空泡細胞數明顯減少，排列趨于整齊，神經元損傷程度明顯減輕。

圖1 大鼠海馬組織HE染色結果(×400)注：A. 正常組；B. 模型組；C. 陽性藥組；D. 左歸降糖解郁方高劑量組；E. 左歸降糖解郁方中劑量組；F. 左歸降糖解郁方低劑量組

3.3 ELISA試劑盒檢測結果

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量均顯著增加，HPA軸亢進明顯(P<0.05)。與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組大鼠血漿ACTH、CORT含量顯著降低(P<0.05)，CRH含量無明顯變化(P>0.05)，說明模型大鼠的HPA軸亢進狀態得到一定緩解。

表1 大鼠血糖值、行為學及HPA軸指標結果比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3.4 Western-blotting檢測結果

圖2顯示，模型大鼠海馬GR表達顯著降低(P<0.01)。在給予高劑量及中劑量的左歸降糖解郁方干預后，GR表達均有不同程度的回升(P<0.01或P<0.05)。

圖2 大鼠海馬GR蛋白的表達情況注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01A. 正常組；B. 模型組；C. 陽性藥組；D. 左歸降糖解郁方高劑量組；E. 左歸降糖解郁方中劑量組；F. 左歸降糖解郁方低劑量組

4 討論

糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，其病機為陰虛燥熱，與肺、脾、腎有關；抑郁癥屬于中醫“郁證”范疇，病位在肝，與心相關，氣血失調是其病機關鍵；而糖尿病并發抑郁癥繼發于糖尿病，其中醫病機可用“虛、瘀、郁”概括，表現為氣陰兩虛、瘀阻腦絡、血瘀肝郁、情志異常等。中醫藥理論指導下的中藥復方治療具有多環節、多靶點的特性，且毒副作用小、療效持久，治療并發癥有獨特優勢[6]。左歸降糖解郁方是以《景岳全書》中左歸丸為基礎方，經載化而得到的臨床經驗方。前期研究發現，左歸降糖解郁方能明顯減輕DD大鼠的糖脂代謝紊亂及抑郁行為，增強海馬神經元突觸可塑性，降低其凋亡水平，延緩海馬損傷[5-7]。本實驗通過檢測DD大鼠血漿HPA軸相關指標以及海馬中GR蛋白的表達，探討左歸降糖解郁方保護海馬神經元的作用機制。

血糖值作為糖尿病的一項關鍵指標，與糖尿病患者抑郁的發病率密切相關[8]。強迫游泳實驗則是使動物處于行為絕望狀態，被廣泛用于抗抑郁藥物的篩選[9]。本實驗發現，左歸降糖解郁方能明顯降低模型大鼠血糖值及不動時間，具有良好的降血糖及抗抑郁效果。同時在給予藥物干預后，DD模型大鼠海馬神經元排列紊亂、胞體腫脹等病理損傷情況得到緩解，進一步說明左歸降糖解郁方對海馬組織的保護作用。

HPA軸是神經內分泌網絡的樞紐，對維持機體內環境平衡起重要作用。研究表明，糖尿病與抑郁癥之間的一個共同發病機制是HPA軸功能紊亂[3,10]。糖尿病時，由于HPA軸基礎活性增高，使腎上腺分泌糖皮質激素增多，透過血腦屏障進入到腦，而海馬是腦中最易受糖皮質激素影響的組織，當海馬中皮質醇含量異常升高時會產生神經毒性，影響大腦的認知功能進而誘發抑郁產生[11]。

GR是一種廣泛分布于海馬組織內的糖皮質激素受體。生理情況下，海馬局部糖皮質激素水平的升高通過與GR結合，發揮其對HPA軸的負反饋抑制作用。而糖尿病狀態下海馬GR表達下降，使其對HPA軸的抑制作用減弱，導致HPA軸晝夜節律消失，持續亢進，分泌糖皮質激素增加[12]。本實驗發現，在給予左歸降糖解郁方干預后，模型大鼠血漿ACTH、CORT水平下降，海馬GR表達回升，說明左歸降糖解郁方能通過上調GR表達保護海馬組織，發揮抗抑郁作用，與文獻報道的抗抑郁藥物上調海馬GR水平相符合[13]。

綜上所述，本實驗研究發現，左歸降糖解郁方發揮抗抑郁作用與緩解HPA軸高亢、上調海馬GR水平密切相關。本研究闡明了左歸降糖解郁方保護海馬組織的部分機制，為中藥復方治療糖尿病合并癥的臨床應用提供了重要的實驗依據。但該復方由多種中藥組成，具有多靶點、多環節等作用特點，其發揮治療作用的藥效物質基礎以及更多潛在的分子機制，仍有待進一步的深入研究。

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