銀杏內酯B對阿爾茨海默病大鼠海馬Synapsin-1、Beclin1 和LC3表達的影響?

田新紅，郝 莉，游言文，徐玉英，于世奇

(河南中醫藥大學基礎醫學院,鄭州 450008)

學習記憶障礙是阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)的主要臨床表現，β淀粉樣蛋白(amyliod-βprotein, Aβ)沉積形成老年斑、神經纖維纏結、突觸丟失是AD的主要病理學改變，其中Aβ引起的突觸丟失是AD學習記憶障礙的主要原因[1-2]。突觸蛋白1(Synapsin-1)是一種與突觸結構、功能密切相關的膜蛋白。自噬又稱為Ⅱ型細胞死亡，是細胞在自噬相關基因(autophagyrelated gene，Atg)調控下利用溶酶體降解自身受損細胞器和大分子物質的過程。自噬相關基因1(Beclin1)和微管相關蛋白輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3) 是哺乳動物細胞自噬的主要相關基因。已有研究證實，AD患者與動物模型大腦自噬水平上調類同[3]，自噬是突觸丟失的主要方式[4-5]。

中藥銀杏葉提取物可改善AD相關學習記憶力下降,而銀杏內酯B(Ginkgobalide B,GB)是銀杏葉提取物的主要活性成分，具有保護神經元、促進學習和改善記憶的作用[6]。實驗證實，GB可改善AD相關的學習記憶缺陷[7]，然而其具體作用機制尚未闡明。 本研究建立Aβ1-42誘導的AD大鼠模型，腹腔注射中藥單體GB，從行為學和分子生物學角度探討GB改善AD相關學習記憶能力下降及突觸相關蛋白Synapsin-1、自噬相關基因Beclin1和LC3在其中的作用，為中藥單體防治AD提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑儀器

雄性清潔級 Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量180～220 g，由河南實驗動物中心提供(合格證號SCXK (豫)2010-0002)。GB購自中國食品藥品檢定研究院；Aβ1-42購自Sigma公司；兔單克隆一抗Synapsin-1、Beclin1和LC3購自Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；Tecnai-12透射電鏡購自飛利浦公司；萊卡顯微成像系統購自萊爾公司；全自動凝膠成像系統購自天能公司；VCX130 超聲破碎儀購自美國Sonics 公司；Stepone 實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 AD動物模型建立 SD大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頭固定于腦立體定位儀上，參考大鼠腦立體定位圖譜：正中做一切口暴露出前囟，以前囟為原點向后4 mm，旁開2.5 mm 左右各鉆一孔，硬腦膜下3 mm至兩側海馬。由微量注射器將2 μL(10μg)Aβ1-42在10 min內注射完畢，留針10 min，使得Aβ1-42充分浸潤局部組織，術后均注射抗生素防止感染。假手術組大鼠注射等量生理鹽水。

1.2.2 分組及治療 將SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組(8只)、模型組(8只)、GB低劑量組(15只)、中劑量組(15只)5組和高劑量組(15只)。模型造成3 d后，GB低、中、高劑量組腹腔注射GB，劑量分別為每天2.5、5和7.5 mg/kg，假手術組和模型組給予等量生理鹽水，均為15 d。

1.2.3 Morris水迷宮檢測學習記憶能力 測試期間室內保持安靜，水池內注入清水并加入墨汁至水不透明，水面高出平臺2 cm。第1天進行預實驗讓大鼠適應環境，同時將其引導到平臺。其后4 d，大鼠每日從不同入水點放入水中， 找到平臺時間即逃避潛伏期，逃避潛伏期記錄為60 s。第6天撤除平臺，將大鼠從任一處放入水池，測試60 s內穿越原平臺位置的次數。行為學檢測期間仍對大鼠進行GB治療。

1.2.4 透射電鏡檢測自噬 水迷宮實驗結束后1 h，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔暴露心臟，灌注生理鹽水沖洗血管，灌注2.5%戊二醛固定。剝離鼠腦，取約1 cm3海馬CA1區組織，置于戊二醛中固定并用磷酸漂洗，乙醇脫水、丙酮包埋，固化、切片、染色，透射電鏡觀察、拍片。

1.2.5 免疫組織化學檢測Synapsin-1、Beclin1和LC3表達 灌注預冷的多聚甲醛進行固定。快速斷頭取腦，多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋切片。脫蠟、修復、PBS清洗，血清封閉，37 ℃孵育20 min；滴加一抗(兔抗Synapsin-1、Beclin1和LC3，稀釋1∶200)，37 ℃孵育過夜；加HRP標記二抗，孵育、DAB顯色，中性樹膠封片。選取海馬CA1區不重疊的5個高倍視野，計算其陽性光密度值。

1.2.6 熒光定量PCR檢測海馬組織Synapsin-1、Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA表達 按照Trizol試劑盒說明書從冰凍海馬組織中快速提取總RNA并逆轉錄成 cDNA。Synapsin-1上游引物：5′-CTGGACTGCGGTATTGAGAC-3′，下游引物：5′-CCGGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′；Beclin1上游引物：5′-GTTCTCTCAGTTGCCTTTC-3′，下游引物：5′-AGCTGTAACCTGTCGCCGAGTCCC-3′；LC3-Ⅱ上游引物：5′-CGGGTTGAGGAGACACACAA-3′，下游引物：5′-ATGAGCCGGACATCTTCCAC-3′；GAPDH上游引物：5′-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3′，下游引物：5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′，均由上海生工生物有限公司合成。按照試劑盒說明書進行擴增,PCR反應總體積為25 μL,反應條件：95 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s,35個循環；72 ℃延伸10 min。由系統軟件自動生成循環域值(Ct)。每個樣品均做3個平行孔，取平均值作為該樣品的Ct值,并計算出Synapsin-1、Beclin1和LC3-Ⅱ相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠 Morris 水迷宮結果

表1顯示，與假手術組比較，模型組大鼠的平均逃避潛伏期延長(P<0.05),去掉平臺后模型組穿越原平臺次數明顯減少(P<0.01)；腹腔注射銀杏內酯B 15 d后，中、高劑量組平均逃避潛伏期時間縮短(P<0.05),穿越原平臺次數增加(P<0.05),行為學結果提示GB具有改善 AD 大鼠學習記憶下降的能力。

表1 各組大鼠 Morris水迷宮實驗結果比較

注：與假手術組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

2.2 各組大鼠海馬CA1區神經元電鏡觀察自噬結果

圖1顯示，與假手術組比較，模型組大鼠電鏡自噬體結構較明顯。隨著GB治療劑量的增加 ，可觀察到自噬體結構逐漸不明顯。

圖1 各組大鼠海馬CA1區神經元自噬電鏡觀察結果(20000×)注：▲代表自噬體

2.3 各組大鼠海馬CA1區Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白和mRNA表達

圖2表2顯示， Synapsin-1的陽性表達部位主要在細胞核周圍的細胞質中，呈深黃色或褐色，細胞核呈藍色。與假手術組比較，模型組大鼠海馬CA1區Synapsin-1蛋白表達降低(P<0.05)呈弱陽性。隨著腹腔注射GB劑量的增加，Synapsin-1蛋白表達逐漸上升呈強陽性，其中GB高劑量組作用最強(P<0.05)。 LC3和Beclin-1主要定位于海馬神經元細胞質中，陽性表達呈棕色。假手術組僅有少量陽性細胞，且著色淺淡；模型組中LC3和Beclin-1胞質的染色程度加深，陽性細胞數明顯增多(P<0.05)。與模型組比較，隨著腹腔注射GB劑量的增加，Beclin-1的表達程度及陽性細胞數逐漸減少(P<0.05)，而LC3有降低的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，提示GB具有提高 AD大鼠海馬CA1區Synapsin-1，降低Beclin-1蛋白表達的能力(圖中箭頭分別表示陽性細胞)。

圖2 各組大鼠海馬CA1區免疫組化Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白表達(400×)

表2顯示，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織Synapsin-1 mRNA水平下降(P<0.01)，Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA水平表達升高(P<0.05)；與模型組比較，GB治療中、高劑量組Synapsin-1和Beclin1 mRNA相對表達量分別增加和降低(P<0.05)；與模型組比較，GB治療中劑量組LC3-ⅡmRNA表達量有降低趨勢(P>0.05)，高劑量組表達量明顯降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬CA1區Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白和mRNA表達

注：與假手術組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3 討論

本研究選擇使用Aβ1-42硬腦膜下注射大鼠兩側海馬建立AD動物模型。學習記憶障礙是AD的主要臨床表現，Morris水迷宮是檢測學習記憶能力的主要行為學方法。它通過讓受試動物在水環境中尋找隱匿平臺，并分析其找到平臺所需時間(逃避潛伏期)及動物穿越隱匿平臺的次數來判斷空間學習記憶能力。本研究通過Morris水迷宮檢測AD動物模型的學習記憶能力，結果與正常組比較，AD模型組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長，去除平臺后模型組穿越原平臺的次數減少，說明Aβ1-42建立的大鼠模型學習記憶能力下降，提示AD動物造模成功，可被用于后續的實驗。

Morris水迷宮中逃避潛伏期越短、穿越隱匿平臺的次數越多，表明受試動物的空間學習記憶能力越好。本研究在Morris水迷宮行為學檢測時觀察到，與AD模型組比較，隨著腹腔注射GB劑量的增加，治療組大鼠逃避潛伏期時間縮短，穿越原平臺次數明顯增加，提示中、高劑量即5和7.5 mg/kg的中藥單體GB具有改善AD大鼠學習記憶下降的能力。

已有研究證實，AD病人和動物模型腦中均存在突觸丟失[8-9]，且突觸丟失較神經元數量減少更顯著。突觸丟失是AD的一個主要病理學特征，是學習記憶障礙的結構基礎[10-11]。促進突觸丟失的主要原因，是病理情況下β淀粉樣前體蛋白(amyliod precursor protein,APP)被2種分泌酶切割產生Aβ，主要是由39～43個氨基酸組成的Aβ40和Aβ422種分子，其中Aβ42比Aβ40疏水性強，易聚集、 易導致AD老年斑塊的形成[12]。Aβ是AD最主要的突觸毒素,可破壞海馬腦片或動物的長時程增強,降低樹突棘密度影響學習記憶[13]。Synapsin-1是進化中高度保守的蛋白質，定位于突觸囊泡膜上，是一種與突觸結構和功能密切相關的特征性膜蛋白，其數量和分布密度可間接反映突觸的密度。AD小鼠模型中，SynapsinⅠ表達水平明顯降低。海馬是參與學習記憶功能的重要結構，也是AD病人腦中最易受累的區域之一。本研究觀察到，Aβ1-42建立的AD大鼠模型海馬組織SynapsinⅠmRNA和蛋白表達下降與文獻基本一致。使用中、高劑量的銀杏內酯B可增加SynapsinⅠ水平。GB是銀杏葉提取物的主要單體。本課題組前期實驗發現，銀杏葉提取物可改善衰老鼠學習記憶力下降[14-15]，且與其提高海馬神經元SynapsinⅠ表達相關。AD是與衰老密切相關的疾病，學習記憶力下降是其主要臨床癥狀。結合本研究觀察到的結果提示，銀杏葉提取物主要可能是通過其中的單體GB改善衰老相關的學習記憶，而這種改善可能與大鼠海馬突觸蛋白SynapsinⅠ表達水平增加有關。

本研究通過透射電鏡觀察各組大鼠海馬CA1區神經元超微結構發現，模型組出現的自噬體大多位于細胞核旁，GB可減少細胞內自噬體數量。自噬與突觸丟失相關，AD動物模型SAMP8小鼠的海馬神經元突觸丟失伴隨LC3陽性細胞數的增加[5]。LC3 是酵母 Atg8 的哺乳動物同源體，是公認的哺乳動物細胞自噬標志物。免疫組化方法檢測到AD模型大鼠海馬LC3蛋白表達增加，與文獻基本一致；而GB對LC3影響不明顯差異無統計學意義。自噬發生時，pro-LC3 被加工成胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)。經自噬相關基因-5(autophagy related gene-5, ATG5) 和自噬相關基因-3(autophagy related gene-5, Atg3)催化，LC3-Ⅰ酶解掉一小段多肽，轉變為一種膜結合形式即 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ是由LC3-Ⅰ轉化而來，LC3-Ⅱ的含量已被證實與自噬體形成有關。由于哺乳動物細胞內LC3-Ⅱ蛋白能夠調控自噬體形成，其表達水平的高低在某種程度上可反映細胞自噬活性[16]。為進一步探討銀杏內酯B對LC3的影響，又檢測了LC3- ⅡmRNA，結果顯示中、高劑量GB可降低AD模型大鼠海馬LC3-ⅡmRNA表達水平。Beclin1基因是酵母ATG6的同系物，調節啟動自噬體的形成，也是哺乳動物細胞自噬的特異性基因。有學者發現，Beclin1在AD腦中的表達增加。本研究AD模型大鼠海馬Beclin1 mRNA和蛋白表達升高，腹腔注射不同劑量的GB后，Beclin1表達水平下降。

臨床上銀杏葉提取物已被應用于缺血性心腦血管疾病的防治，GB是銀杏葉提取物的主要有效成分之一。本研究觀察到，GB可改善AD模型大鼠學習記憶力下降，提高突觸相關蛋白SynapsinⅠ表達，這些作用可能與GB降低海馬神經元自噬水平有

[20] 王永炎, 謝穎楨. 化痰通腑法治療中風病痰熱腑實證的源流及發展(二)——化痰通腑法治療后的不同證候演變及疾病轉歸與治療[J]. 北京中醫藥大學學報：中醫臨床版, 2013,20(2):1-3.

[21] 王綸. 明醫雜著[M].薛己注.王新華，點校. 南京: 江蘇科學技術出版社，1995：130.

[22] 朱震亨.丹溪心法[M].趙建新， 點校. 北京: 人民軍醫出版社，2007：12.

[23] 涂佳玉, 阿基業, 王廣基, 等. 通塞脈微丸干預缺血性中風模型大鼠的血漿代謝組學研究[J]. 中國中藥雜志, 2012,37(7):1028-1033.

[24] 張允嶺, 張錦, 扈新剛, 等. 制作缺血性中風氣虛血瘀證大鼠模型的實驗研究[J]. 中國中西醫結合雜志, 2009,29(4):343-346.

[25] 朱震亨.丹溪心法[M].趙建新，點校. 北京: 人民軍醫出版社，2007：325.

[26] 吳立本.女科切要[M].佘德友， 點校. 北京: 中醫古籍出版社，1999：20.

[27] 楊正望, 周芳, 談珍瑜, 等. 不同造模方法對大鼠多囊卵巢綜合征模型的影響[J]. 中國實驗動物學報, 2010,18(1):13-16.

[28] 王瑞杰, 李暉, 邱方, 等. 補腎活血化痰湯對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢血供及形態的影響[J]. 中國藥房, 2017,28(4):479-482.

[29] 田碩, 白明, 苗明三. 基于圍絕經期綜合征臨床病癥特點的動物模型分析[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2015,21(19):217-221.

[30] 雜 證謨選讀編寫點校組.景岳全書·雜證謨選讀[M]. 重慶: 重慶大學出版社，1988：141.

[31] 鞠大宏, 張春英, 王安民, 等. 左歸丸對去卵巢所致大鼠骨質疏松癥的治療作用[J]. 中國中醫基礎醫學雜志, 2001,7(3):17-20.

[32] 王景, 李小梅, 洪苑. 脂代謝及血清脂聯素水平與絕經后骨質疏松癥的相關性研究[J]. 實用婦產科雜志, 2014,30(11):828-830.

[33] 成龍, 申竹芳, 孫桂波, 等. 糖尿病動物模型研究進展及在中藥研究中的應用[J]. 藥學學報, 2015,50(8):951-958.

[34] 戴紅, 鄒小娟, 趙厚睿, 等. 不同STZ劑量造模對2型糖尿病動物模型證候屬性影響的研究[J]. 時珍國醫國藥, 2015,26(3):751-755.

[35] 陳婧, 易瑋, 許能貴, 等. OLETF大鼠自發性2型糖尿病動物模型研究概述[J]. 廣州中醫藥大學學報, 2015,32(1):178-182.

[36] 熊興江, 王階. 從痰論治糖尿病[J]. 中國中醫基礎醫學雜志, 2008,14(12):923-924.

[37] 田思勝， 等.朱丹溪醫學全書[M]. 北京: 中國中醫藥出版社,2006:72.

[38] 石變, 袁秀霞, 秦志豐, 等. 論痰濁內阻與腫瘤發生[J]. 中華中醫藥雜志, 2012,27(9):2389-2393.

[39] 王文萍, 王垂杰. 腫瘤轉移的“痰毒流注”理論形成基礎及實踐意義[J]. 中國中醫基礎醫學雜志, 2002,8(5):4-6.

[40] 郭蕾, 王永炎, 張俊龍, 等. 濁邪在動脈粥樣硬化疾病中的病機學意義[J]. 世界中西醫結合雜志, 2012,7(2):163-165.

[41] 齊錫友, 董致郅, 謝春榮. 從病因病機談頸動脈粥樣硬化與痰濁的關系[J]. 北京中醫藥, 2012,31(6):480-481.

[42] 覃光輝, 王驍, 楊亞魁, 等. 從痰論治高黏滯血癥[J]. 遼寧中醫藥大學學報, 2008,10(2):84-85.

[43] 周明學, 徐浩, 陳可冀, 等. 活血解毒中藥有效部位對ApoE基因敲除小鼠血脂和動脈粥樣硬化斑塊炎癥反應的影響[J]. 中國中西醫結合雜志, 2008,28(2):126-130.

[44] 衡先培, 黃蘇萍, 程心玲, 等. 丹栝方干預糖尿病動脈粥樣硬化大鼠糖脂代謝及氧化應激研究[J]. 中國中西醫結合雜志, 2013,33(2):244-251.

[45] 賈明賢, 余婕, 張媛, 等. 冠心病動物模型建立研究[J]. 世界科學技術：中醫藥現代化, 2013,15(8):1735-1740.

[46] 任毅, 陳可冀, 張敏州, 等. 405例冠心病患者冠狀動脈造影結果與中醫證型的相關性[J]. 中醫雜志, 2010,51(8):725-728.

[47] 劉建勛, 林成仁, 任建勛, 等. 小型豬痰瘀互結證冠心病“痰、毒、瘀”病機演變規律的實驗研究[J]. 中國中藥雜志, 2013,38(23):4138-4143.