C-ROSE技術在診斷性介入呼吸病學中的應用

王偉 綜述 于力克 徐春華 審校

·綜述·

C-ROSE技術在診斷性介入呼吸病學中的應用

王偉 綜述 于力克 徐春華 審校

近年來超聲支氣管鏡、針吸細胞學檢查(fine-needle aspiration, FNA)，超聲內鏡下經支氣管鏡針吸活檢(endobronchial ultrasound- guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA)，電磁導航，超細支氣管鏡等診斷性介入技術的迅速發展，大大拓展了內鏡醫師的工作視野，提高了肺臟、縱隔、胸膜等常規支氣管鏡下不可視病灶、尤其惡性腫瘤標本取材的成功率，使得診斷性介入技術發展到了新的高度和廣度，其發展在很大程度上代表了一個呼吸專科臨床診治水平的高低[1]。然而，任何標本取材過程對患者都存在創傷風險，如何判斷標本的充足度和有效性避免不必要的取材。如何給介入醫師以合理、準確的現場反饋？如何在有效取材和規避風險之間尋求最佳平衡？這些是每位呼吸介入醫師工作中始終需要面對的實際問題[2]。快速閱現場評估(rapid on-site evaluation，ROSE)是一種在穿刺、活檢、刷片等方法收集標本時,相關人員在場，對所得標本滿意度進行快速評價、得出初步診斷和優先策略，反饋指導下一步操作的技術。ROSE分為現場細胞學評估(cytological rapid so-site evaluation，C-ROSE)和現場微生物學評估(microbiological rapid so-site evaluation M-ROSE)，本文擬就C-ROSE在診斷性介入呼吸病學中的應用現狀和進展做一綜述，意在引起更多同道的關注和思考。

C-ROSE 技術的概念、起源

C-ROSE是一種伴隨于診斷性介入呼吸病學操作的“極速細胞學判讀技術”，其判讀內容包括：細胞形態、分類、計數、構成比、排列、相互關系、背景及外來物分析。國外有關C-ROSE技術最早的系統研究分析是Austin 和Cohen在1993年對接受CT 引導下經皮肺針吸活檢(CT-guide percutaneous fine-needle aspiration，CT-PFNA)操作的55位疑診肺癌者進行分組處理，發現有ROSE指導操作的一組診斷陽性率明顯高于非ROSE組，提示ROSE 可以提高診斷陽性率，減少無謂取材，降低并發癥風險[3]。前十余年C-ROSE技術國外報道多用于胰腺、甲狀腺穿刺等方面[4-6]，在呼吸介入領域應用較少，近年來由于各種呼吸內鏡和導航技術的發展，C-ROSE在呼吸介入領域的作用日益突出[7]，國內目前已有少數醫療機構開展該項技術，并取得良好效果[1]。

C-ROSE 技術的操作方法

C-ROSE是指取材現場對標本玻片進行快速染色并采用光學/熒光顯微鏡實時判讀細胞學病理，其具體操作分為：制片→染色→閱片判讀三步驟。由于ROSE目的是實時指導介入現場進程，故其技術核心在于兩點：① 盡可能提高制片和染色的速度；② 準確判讀細胞學結果。

目前ROSE的快速制片方式主要有以下幾種[8]：①印片(又稱滾片)法，適用于：支氣管鏡病灶黏膜活檢、肺穿刺活檢、內科胸腔鏡活檢取材等實質性組織塊；②噴片(又稱畫片)法：適用于C-TBNA、EBUS-TBNA、FNA等針吸標本；③涂片(又稱刷片)法：用于多數經支氣管鏡、胸腔鏡防污染毛刷取材的標本；或含粘液的標本；④液基薄層細胞制片法(TCT)法：用于胸腔積液、支氣管灌洗液、FNA、TBNA的標本。

標本制片成功后即予染色，目前用于C-ROSE的染色劑主要有：① 改良快速瑞氏-姬姆薩染色(modified rapid Papanicolaou stain)：是在瑞氏-姬姆薩染色基礎上改良而成的一種快速染色，45 s 即可完成，具體步驟：先滴加染色液覆蓋細胞涂片區域，再加二倍蒸餾水混勻，水洗待干鏡檢。該方法特點：靈敏度及特異性較高，胞核顯示清晰，操作簡便，單人可行，C-ROSE染色可予采用[9-10]。② 改良快速巴氏染色(modified rapid Papanicolaou stain)：也是一種較常用的快速染色法。有研究認為其靈敏度、診斷率都較高[11]，但巴氏標本染色操作需15個步驟，耗時約3 min，在C-ROSE 過程中多需技師幫助，故其臨床應用受到一定限制。③ 迪夫快速染色(Diff-quik stain) 試劑：是在瑞氏染色基礎上加以改良所形成的一種極快速染色劑，由甲醇固定液、伊紅、亞甲藍組成的試劑組套。該染色耗時僅約30s，大多于60s內即可在顯微鏡下觀察，簡便、快速、高效，是C-ROSE 最常用的染色方式，也是現階段WHO唯一推薦的標準ROSE染色方法[12]，亦多為國內開展C-ROSE的醫院所采用[1]。

除外上述試劑外，也有少數研究認為HE染色在EBUS-TBNA-C-ROSE中[13]，Hemacolor染色在內科胸腔鏡標本中[14]，可呈現良好染色效果。

雖然各種染色劑各有優勢，但基于C-ROSE為快/極速染色，難認進行常規病理標本洗脫，因此如何甄別標本背景污染，剔除無價值制片，把握ROSE的質量控制——這些仍是令人關注的問題，現已有部分研究對此展開探索。Sun Mi Choi等認為：大于2cm的組織、碳末色素沉著、淋巴細胞密度等因素或與C-ROSE標本質量相關[15]；Daisuke Minam等在C-ROSE-TBNA 過程中采用BIOEVALUATOR?裝置來分選出現合乎條件的標本。Bioevaluator 是一種可以區別組織還是其他成分(例如血液)的裝置，C-ROSE評估中組織成分呈現為白色，血液等，則呈現為紅色[16]。新近有“一站式快速診斷”之稱的波譜庫ROSE技術，則可將ROSE制片波譜與波譜庫進行快速對照，從而得到診斷，改變了傳統C-ROSE細胞學概念，是對ROSE技術的創新[17]。這些研究表明現代C-ROSE技術已得到更進一步的重視和發展。

C-ROSE 在診斷性介入呼吸病學中的應用

近年來隨著各種導航技術和各類型內鏡的長足發展，介入呼吸病學已成為現代呼吸專科最活躍的分支之一，為經人體自然腔道進行呼吸病診斷提供了廣闊空間。C-ROSE技術可在呼吸介入現場進行實時評估，給內鏡醫師予快速反饋，幫助制定臨床操作策略，可謂是診斷性呼吸介入的“伴侶技術”。下文對其應用予以具體介紹。

一、C-ROSE配合呼吸介入新技術在呼吸系統疾病診斷中的應用

1 肺門和縱隔病灶的診斷和縱隔淋巴結分期

肺門和縱隔病灶(包括淋巴結)的病理診斷是呼吸病的難點之一，以往多需縱隔鏡進行，創傷風險大，醫療投入高，需一定條件的醫院方可開展。經支氣管鏡超聲針吸(EBUS-TBNA)通過超聲引導，可對普通支氣管鏡下無法發現的肺門、縱隔病灶進行取材，在肺門縱隔疾病診斷和肺癌患者淋巴結分期方面具有獨特優勢。國外大量文獻表明，C-ROSE技術配合EBUS-TBNA或C-TBNA，可以減少不必要的穿刺，減少操作相關并發癥，指導現場操作進程，提高診斷陽性率。Collins等聯合TBNA和C-ROSE取材，發現ROSE組可減少33%的無謂穿刺和30%的無謂涂片；有68%的患者由于使用了C-ROSE技術，使得TBNA一次穿刺即獲得成功[7]。2015年Cancer letters報道，將236例肺癌合并肺門縱隔淋巴結大的患者分為ROSE(122人，252個淋巴結)和非ROSE(114人，260個淋巴結)兩組，進行EBUS-TBNA術，用未確診率來比較二組診斷效能。結果發現，ROSE組中細胞學、組織學的未診斷率均低于非ROSE組，數據分別是8.7%vs.14.6%，P=0.038；0.9%vs4.4%，P=0.018。該研究提示在EBUS-TBNA中采用ROSE技術可降低無效標本率，幫助獲取陽性診斷[18]。

Rokadia等[19]對625例平均直徑約14.4(±7.9)mm的縱隔腫大淋巴結患者進行TBNA+C-ROSE檢查，發現ROSE確診肺門縱隔良性肉芽腫病變的結果與最終病理的符合率達81.6%，該研究表明，不僅惡性疾患，C-ROSE技術也可幫助肺門縱隔良性病灶進行現場快速診斷。

然而，也有不同觀點表明C-ROSE并未幫助提高TBNA的陽性診斷率。例如，Liu QH等回顧研究認為C-ROSE有助于指導EBUS-TBNA操作進程，但并未提高TBNA的病理診斷率[20]。Monaco SE等研究認為，C-ROSE對EBUS-TNBA的診斷率無明顯影響，但有助于保障標本的有效性和充足度，能為流式細胞、免疫染色和分子病理學等后繼檢測提供優選標本[21]。Madan等按照1 ∶1 ∶1 ∶1將80例患者分為常規TBNA+ROSE、常規TBNA、EBUS-TBNA+ROSE和單純EBUS-TBNA共4組，操作結果發現常規TBNA中，聯合ROSE組的患者診斷率高于非ROSE組，在EBUS-TBNA兩組中，有無采用ROSE對診斷率無明顯影響，這與和Liu QH和Monaco SE等觀點類似。這項研究還發現，聯合ROSE組的患者在介入操作中鎮靜劑使用量和操作時間均低于未采用ROSE組[22]。

2 肺外周型病灶

Steinfort DP[23]等對128例肺外周型病灶(pulmonary peripheral lesion, PPLs)患者進行前瞻性隊列研究，在徑向超聲(radial probe endobronchialultrasound,R-EBUS)引導下進行標本取材，發現取材所耗時間，C-ROSE組 vs 非ROSE組=(19±8)min vs(31±11)min，Plt;0.0001。C-ROSE組的診斷陽性率達97%，且未見明顯操作并發癥故認為ROSE+R-EBUS的法有助于提高外周型肺癌的診斷率，縮短操作時間，降低并發癥風險。Chen 等[24]對815 例肺外周病變患者進行R-EBUS引導下的經支氣管刷檢或肺活檢，其中279 例患者被隨機挑出，接受C-ROSE。研究結果發現，肺外周病變的診斷率：C-ROSE 組 vs非C-ROSE 組：88.9% vs 74.5%，有統計學差異，提示C-ROSE 有助于提高肺外周病變的診斷效能。報道中還發現，對于右肺尖、左舌段等一些較難取材部位的病變，C-ROSE 組vs 非C- ROSE 組的診斷率是77.4% vs 56.8%，仍有統計學差異。上述研究表明徑向支氣管腔內超聲聯合C-ROSE技術，可有助于準確合理取材，提高PPLs的診斷效能，并降低并發癥風險。

3 胸膜病變中的應用

部分較難診斷的胸膜或胸壁病變需取得組織病理，但胸膜、胸壁面積較廣，如何能有效、成功地取材？是介入操作的關鍵。Profyrides等對61例接受內科胸腔鏡的患者進行C-ROSE，發現ROSE現場診斷惡性病率86%，敏感度79%，特異度95%，陽性診斷率89%，結論認為：C-ROSE配合內科胸腔鏡，能提高胸膜惡性疾病的診斷率，幫助腔鏡醫師現場制定取材策略[14]。Mfokazi A等對胸部占位灶予以經胸壁穿刺術取材，查液基、涂片、組織病理，結果表明，常規液基病理的診斷率明顯低于涂片細胞病理，然而加入C-ROSE參與修正指導后，液基病理學診斷率明顯提高[25]。

上述各項研究提示，無論是位于中央、外周、或胸膜的呼吸系統病變，聯合采用C-ROSE技術，均可提高合理取材率，提高診斷效能，令患者獲益。

二、C-ROSE在呼吸系疾病分子生物學檢測中的應用

由于ROSE技術可幫助取得合理有效充足的標本，使得對優選標本進行后繼檢測成為可能[21]。陽性的C-ROSE標本可用于做細胞塊；或繼續流式細胞、免疫染色和分子生物學檢測，為制定臨床決策和個體化治療提供重要幫助。Celik B等對確診為非小細胞肺癌的75例患者癌組織標本進行C-ROSE和甲狀腺轉錄因子-1(thyroid transcription factor-1，TTF-1)、p53免疫組化染色，結果發現，C-ROSE聯合IHC等技術可幫助未分類-非小細胞肺癌的分型[26]。2015年Chest報道在126例進展期肺癌患者中完成了108例基因分型檢測，發現采用ROSE組的患者能以最小量組織獲得肺癌病理分析，其取材進行基因分型的成功率約90.8%，大于未采用ROSE組[27]。這些研究提示，C-ROSE技術或許可使現場快速診斷到分子病理的宏—微觀一體化轉變成為可能。

C-ROSE的操作者

C-ROSE的快速制片染色方法，普通臨床、醫技工作者，通過短期學習都可掌握，而C-ROSE的閱片判讀才是現場評估的重點。依據Guidelines ofthe Papanicolaou Society of Cytopathology 的指導，目前C-ROSE標本的判讀結果及滿意度可分為C1-C5五類：C1 ：無診斷價值的標本或標本不適當，即無效標本；C2 ：良性病變；C3：良、惡性均有可能；C4 ：可疑惡性；C5：惡性病變[28]。C-ROSE是否成功，關鍵在于操作者制片閱片的經驗水平。既往有關C-ROSE的研究文獻多傾向于由細胞病理學家進行判讀。誠然，病理科醫師的專業知識對C-ROSE診斷極具價值；然而，國內醫療機構的病理科醫師大多工作繁忙，無法派出長期、固定人員進行此項工作，同時，勞務分配層面也存在一定操作困難，故不易推廣。國外曾報道生物醫學科學家幫助判讀C-ROSE[12]，但成本較高，尚處于嘗試階段。令人鼓舞的是，呼吸介入醫師因熟悉患者病史，臨床特征，影像學，血、痰等臨床資料結果，同時具有臨床專科邏輯整合能力，因此自己開展C-ROSE工作判讀實具天然優勢；如能經過專科培訓，也可勝任C-ROSE的現場閱片診斷任務。2014年Chest雜志發表的一項研究表明，肺科醫師經過3個月的細胞病理學知識培訓后，進行C-ROSE，準確率達80%，與細胞病理學家92%的準確率相比，未見統計學差異[29]。作者所在呼吸腔鏡中心初步開展C-ROSE工作，現約150例，大部分由呼吸介入醫師判讀，少部分細胞形態疑難或不典型者請病理科醫師到場指導閱片。初步評價，經呼吸介入醫師判讀的C-ROSE為惡性疾病者，與最終病理結果的符合率約93%，支持Chest雜志的研究觀點。故此認為，呼吸介入醫師開展C-ROSE工作具有較好前景，且能節約醫院人力資源。

小結與展望

雖然C-ROSE在提高呼吸系疾病診斷率的價值還有爭議[20]，但該技術在快速現場評估標本充足度、減少不必要取材，縮短操作時間，降低并發癥，節約醫療資源，幫助制定臨床診療策略等方面均具有積極意義。同時，雖已出現關于ROSE的盲法試驗[30]，但進一步客觀評估C-ROSE在呼吸介入診斷方面的應用價值還需更多前瞻性、多中心、大樣本的隨機對照研究。總言之，隨著精準醫學診療理念的普及，各種呼吸導航技術[31]的發展、生物科技中數學模型的優化[15]以及遠程信息學[32]的參與，相信C-ROSE技術在呼吸介入領域的實際應用將更具廣闊空間，有條件的單位機構和呼吸科醫師宜重視投入開展C-ROSE，以便幫助臨床制定個體化診療策略，更好地服務于病患。

[1] 馮婧.介入呼吸病學的快速現場評價[J].現代實用醫學,2016,28(1):5-7.

[2] Jeffus SK,Joiner AK,Siegel ER,et al.Rapid on-site evaluation of EBUS-TBNA specimens of lymph nodes: Comparative analysis and recommendations for standardization[J].Cancer Cytopathol,2015,123(6):362-372.

[3] Austin JH,Cohen MB.Value of having a cytopathologist present during percutaneous fine-needle aspiration biopsy of lung: report of 55 cancer patients and metaanalysis of the literature[J].AJR Am J Roentgenol,1993,160(1):175-177.

[4] Shield PW,Cosier J,Ellerby G,et al.Rapid on-site evaluation of fine needle aspiration specimens by cytology scientists: a review of 3032 specimens[J].Cytopathology,2014,25(5):322-329.

[5] Bernasconi M,Casutt A,Koutsokera A,et al.Radial Ultrasound-Assisted Transbronchial Biopsy: A New Diagnostic Approach for Non-Resolving Pulmonary Infiltrates in Neutropenic Hemato-Oncological Patients[J].Lung,2016,194(6):917-921.

[6] Khurana KK, Xu W, Wang D, et al. Rapid on-site evaluation with dynamic telecytopathology for ultrasound-guided fine-needle aspiration of head and neck nonthyroid lesions[J].J Pathol Inform,2015,6:19.

[7] Collins BT,Chen AC,Wang JF,et al.Improved laboratory resource utilization and patient care with the use of rapid on-site evaluation for endobronchial ultrasound fine-needle aspiration biopsy[J].Cancer Cytopathol,2013,121(10):544-551.

[8] 歐振宇,周愛蓮.現場細胞學評估在介入肺臟病學中的應用現況[J].臨床肺科雜志,2015,20(10):1886-1889.

[9] Louw M,Brundyn K,Schubert PT,et al.Comparison of the quality of smears in transbronchial fine-needle aspirates using two staining methods for rapid on-site evaluation[J].Diagn Cytopathol,2012,40(9):777-781.

[10] 李凱述,李新軍,姜淑娟,等.快速現場細胞學評價的染色方法[J].中華結核和呼吸雜志,2015,38(6):472-474.

[11] Diacon AH,Koegelenberg CF,Schubert P,et al.Rapid on-site evaluation of transbronchial aspirates: randomised comparison of two methods[J].Eur Respir J,2010,35(6):1216-1220.

[12] Schacht MJ,Toustrup CB,Madsen LB,et al.Endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration: performance of biomedical scientists on rapid on-site evaluation and preliminary diagnosis [J].Cytopathology,2016,27(5):344-350.

[13] Mallya V,Kumar SP,Meganathan P,et al.The utility of ROSE (rapid on-site evaluation) in endobronchial ultrasound (EBUS)-guided transbronchial needle aspiration (TBNA): Is the picture rosy[J].J Cytol,2015,32(4):230-233.

[14] Porfyridis I,Georgiadis G,Michael M,et al.Rapid on-site evaluation with the Hemacolor rapid staining method of medical thoracoscopy biopsy specimens for the management of pleural disease[J].Respirology,2016,21(6):1106-1112.

[15] Schmidt RL,Walker BS,Cohen MB.When Is Rapid On-Site Evaluation Cost-Effective for Fine-Needle Aspiration Biopsy[J].PLoS One,2015,10(8):e0135466.

[16] Minami D,Takigawa N,Inoue H,et al.Rapid on-site evaluation ROSE with BIOEVALUATOR during endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for diagnosing pulmonary and mediastinal diseases[J].Ann Thorac Med,2014,9(1):14-17.

[17] Darwiche K,Zarogoulidis P,Krauss L,et al.quot;One-stop shopquot; spectral imaging for rapid on-site diagnosis of lung cancer: a future concept in nano-oncology[J].Int J Nanomedicine, 2013,8:4533-4542.

[18] Guo H,Liu S,Guo J,et al.Rapid on-site evaluation during endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for the diagnosis of hilar and mediastinal lymphadenopathy in patients with lung cancer[J].Cancer Lett,2016,371(2):182-186.

[19] Rokadia HK,Mehta A,Culver DA,et al.Rapid On-Site Evaluation in Detection of Granulomas in the Mediastinal Lymph Nodes[J].Ann Am Thorac Soc,2016,13(6):850-855.

[20] Liu QH,Arias S,Wang KP.International association for the study of lung cancer map, Wang lymph node map and rapid on-site evaluation in transbronchial needle aspiration[J].J Thorac Dis,2016,8(9):E869-E874.

[21] Monaco SE,Pantanowitz L,Khalbuss WE,et al.Comparing endobronchial ultrasound-guided fine needle aspiration specimens with and without rapid on-site evaluation[J].Cytojournal,2012,9:2.

[22] Madan K,Dhungana A,Mohan A,et al.Conventional Transbronchial Needle Aspiration Versus Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration, With or Without Rapid On-Site Evaluation, for the Diagnosis of Sarcoidosis: A Randomized Controlled Trial [J]. J Bronchology Interv Pulmonol,2017,24(1):48-58.

[23] Steinfort DP,Leong TL,Laska IF,et al.Diagnostic utility and accuracy of rapid on-site evaluation of bronchoscopic brushings[J].Eur Respir J,2015,45(6):1653-1660.

[24] Chen CH,Cheng WC,Wu BR,et al.Improved diagnostic yield of bronchoscopy in peripheral pulmonary lesions: combination of radial probe endobronchial ultrasound and rapid on-site evaluation[J].J Thorac Dis,2015,7(Suppl 4):S418-S425.

[25] Mfokazi A,Wright CA,Louw M,et al.Direct comparison of liquid-based and smear-based cytology with and without rapid on-site evaluation for fine needle aspirates of thoracic tumors[J].Diagn Cytopathol,2016,44(5):363-368.

[26] Celik B,Khoor A,Bulut T,et al.Rapid On-site Evaluation Has High Diagnostic Yield Differentiating Adenocarcinoma vs Squamous Cell Carcinoma of Non-Small Cell Lung Carcinoma, Not Otherwise Specified Subgroup[J].Pathol Oncol Res,2015,21(1):167-172.

[27] Trisolini R,Cancellieri A,Tinelli C,et al.Randomized Trial of Endobronchial Ultrasound-Guided Transbronchial Needle Aspiration With and Without Rapid On-site Evaluation for Lung Cancer Genotyping[J].Chest,2015,148(6):1430-1437.

[28] Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice [J].Diagn Cytopathol,1999,21(1):61-69.

[29] Bonifazi M,Sediari M,Ferretti M,et al.The role of the pulmonologist in rapid on-site cytologic evaluation of transbronchial needle aspiration: a prospective study [J].Chest, 2014,145(1):60-65.

[30] Jeffus SK,Joiner AK,Siegel ER,et al.Rapid on-site evaluation of EBUS-TBNA specimens of lymph nodes: Comparative analysis and recommendations for standardization[J].Cancer Cytopathol,2015,123(6):362-372.

[31] Wang Memoli JS,Nietert PJ,Silvestri GA.Meta-analysis of guided bronchoscopy for the evaluation of the pulmonary nodule[J]. Chest,2012,142(2):385-393.

[32] Khurana KK,Kovalovsky A,Wang D,et al.Feasibility of dynamic telecytopathology for rapid on-site evaluation of endobronchial ultrasound-guided transbronchial fine needle aspiration[J].Telemed J E Healt,2013,19(4):265-271.

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