胰腺癌中l(wèi)ncRNA和mRNA表達(dá)譜分析及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究

張美晨，魏文竹，盧星宇，湯文瀛，王迪，劉躍娟

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)醫(yī)學(xué)信息學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

0 引言

胰腺癌（pancreaticcancer，PC）因其起病隱匿、早期診斷難、手術(shù)切除困難、放化療不敏感以及預(yù)后差、死亡率高等原因，成為危害最大的惡性腫瘤之一。我國(guó)胰腺癌發(fā)病率近20年來(lái)增長(zhǎng)了將近6倍，居惡性腫瘤死亡率的第5位，因此積極尋找對(duì)胰腺癌有更好診斷意義的臨床指標(biāo)尤為重要。目前，越來(lái)越多研究表明，癌癥的發(fā)生與基因突變、缺失和表達(dá)障礙有關(guān)。本研究利用胰腺癌芯片數(shù)據(jù)，計(jì)算得到差異表達(dá)的mRNA和lncRNA，結(jié)合蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)，構(gòu)建失調(diào)的lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)挖掘網(wǎng)絡(luò)功能模塊，初步探索其作用機(jī)制，為揭示胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中l(wèi)ncRNA與其靶基因的關(guān)系和作用機(jī)制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌的lncRNA和mRNA表達(dá)譜

我們從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO)中下載了編號(hào)為GSE61166的基因芯片數(shù)據(jù)。本研究從中選取4個(gè)胰腺癌患者和4個(gè)胰腺炎患者胰腺組織的lncRNA和mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)作為研究對(duì)象。

1.2 BLAST序列比對(duì)

利用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，在基因芯片GPL61166平臺(tái)上下載序列信息，同時(shí)在GENECODE數(shù)據(jù)庫(kù)下載人類基因序列，利用計(jì)算機(jī)軟件比對(duì)，通過(guò)BioMart數(shù)據(jù)庫(kù)，將Ensembl Gene ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol。然后我們做了標(biāo)準(zhǔn)化和以2為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，若多個(gè)探針集對(duì)應(yīng)一個(gè)基因，則取其平均值作為該基因的表達(dá)量，共獲得6530個(gè)mRNA和31個(gè)lncRNA，全部數(shù)據(jù)處理流程如圖1所示。

1.3 差異基因篩選

差異基因通過(guò)基因芯片顯著性分析方法（SAM）篩選，SAM方法根據(jù)芯片數(shù)據(jù)噪音大小與表達(dá)峰度進(jìn)行修改，其優(yōu)點(diǎn)是在得到較多特征基因的同時(shí)，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）還保持在較低水平。利用SAM方法，閥值設(shè)定為P＜0.05，得到差異表達(dá)的820個(gè)mRNA和16個(gè)lncRNA。

1.4 相關(guān)分析

圖1 流程圖

相關(guān)分析法是對(duì)具體有依存關(guān)系的現(xiàn)象探討其相關(guān)方向以及程度的一種統(tǒng)計(jì)方法。本研究對(duì)差異表達(dá)的820個(gè)mRNA和16個(gè)lncRNA計(jì)算皮爾森相關(guān)系數(shù)，取系數(shù)大于0.8且P＜0.05的強(qiáng)相關(guān)對(duì)構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建lncRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)上一步得到的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，從HPRD（Human Protein Reference Database）數(shù)據(jù)庫(kù)下載人類蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)，得到人的PPI網(wǎng)絡(luò)，并將lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)取交集，然后對(duì)交集的mRNAs在PPI中選取直接鄰居結(jié)點(diǎn)，和原共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)一起形成lncRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。

1.6 網(wǎng)絡(luò)模塊挖掘

利用Cytoscape軟件中的JActiveModules插件進(jìn)行模塊挖掘，獲得5個(gè)網(wǎng)絡(luò)功能模塊。用ClusterOne和Netmine對(duì)模塊進(jìn)行聚類和進(jìn)一步挖掘，尋找p-value＜0.05的顯著性lncRNA-mRNA互作對(duì)。

1.7 Gene ontology(GO)分析

通過(guò)來(lái)自R/bioConductor的clusterProfiler包完成了對(duì)模塊中編碼基因的GO terms富集度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出這些基因的GO term的p-value和p-value的FDR值，定位這些基因最可能相關(guān)的GO term。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá) lncRNAs、mRNAs

對(duì)胰腺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到差異表達(dá)的mRNAs、lncRNAs數(shù)量分別為820、16個(gè)。通過(guò)比較差異mRNAs的前5%和全部的lncRNAs在不同樣本中的表達(dá)量（見(jiàn)圖2、圖3），我們發(fā)現(xiàn)這些mRNAs與lncRNAs在胰腺癌患者中低表達(dá)。

圖2 lncRNA和mRNA表達(dá)

2.2 網(wǎng)絡(luò)的全局特征

構(gòu)建的lncRNA—mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)共包含了826個(gè)結(jié)點(diǎn)和7176條邊，涉及到16個(gè)lncRNA和810個(gè)mRNA，利用Cytoscape可視化網(wǎng)絡(luò)（如圖4）對(duì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)整合并得到一個(gè)包含2373個(gè)結(jié)點(diǎn)和8626條邊，涉及到16個(gè)lncRNA和2357個(gè)mRNA的lncRNA—mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)拓?fù)鋵傩苑治?如圖5)，我們發(fā)現(xiàn)MIR7-3HG具有較大的度585，平均鄰居結(jié)點(diǎn)12，較小的聚類系數(shù)0.447，大多數(shù)的路徑長(zhǎng)度在2-5之間。

圖3 lncRNA和mRNA直方圖

圖4 lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

圖5 網(wǎng)絡(luò)度分布

2.3 網(wǎng)絡(luò)功能模塊

對(duì)lncRNA—mRNA互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊挖掘，得到5個(gè)模塊。我們發(fā)現(xiàn)LINC00670與CCL2關(guān)系對(duì)在四個(gè)模塊中都出現(xiàn)，LINC00670是一個(gè)存在轉(zhuǎn)錄因子CTCF綁定位點(diǎn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，CTCF蛋白在印記調(diào)控區(qū)域和分化甲基化區(qū)域1和MAR3結(jié)合可抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子2基因[14]。另外，我們對(duì)與LINC00670有互作關(guān)系的靶基因做GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，其靶基因以最顯著的形式富集在了胰液分泌通路上。

在模塊一中，LINC00670的介數(shù)達(dá)到0.021,遠(yuǎn)高于平均介數(shù)值0.008。CCL2趨化因子及其受體可加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并聚集免疫細(xì)胞等機(jī)制以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，CCL2-CCR2信號(hào)通道在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，尤其是在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的早晚期[15]。LINC00670同時(shí)還與IL6和NFASC相連。其中，IL6（白細(xì)胞介素-6），是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分。有研究表明IL6與癌細(xì)胞增殖以及許多胰腺癌病人的惡病質(zhì)過(guò)程有關(guān)。在模塊二中受體活性修飾蛋白1（RAMP1）可以與降鈣素受體（CTR）直接作用產(chǎn)生胰淀粉樣酶(AMY)受體，在胰腺腫瘤引起的胰腺導(dǎo)管阻塞、胰腺膿腫、胰腺損傷中AMY高表達(dá)。有研究表明ADM能夠增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲性。與LINC00671相聯(lián)的IAPP在II型糖尿病中會(huì)引起β細(xì)胞凋亡。用一種具有中和抗體的細(xì)胞特異性促進(jìn)劑明顯減少了病變的活性巨噬細(xì)胞積累，從而減少纖維化和病灶的生長(zhǎng)。在模塊四中CKM,DCX,IL6,IAPP都在模塊一、二、三中出現(xiàn)，CKM,DCX,IL6同時(shí)連接LINC00670。有研究表明在胰腺癌中從UCM中更快地釋放出DOX，在凋亡的外圍細(xì)胞中可能會(huì)停止內(nèi)吞作用和胞吐作用，有研究表明組織和血液的MMP9增加反映了胰腺癌與糖尿病相關(guān)。

2.4 模塊的功能分析

對(duì)模塊中編碼基因進(jìn)行GO功能富集分析結(jié)果見(jiàn)圖6。通過(guò)來(lái)自R/bioConductor的clusterProfiler數(shù)據(jù)包，我們完成了模塊中編碼基因的GO term富集度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，閥值選取為Bonferroni校正P值 ＜0.01。

圖6第一排從左至右分別是模塊一、三、五，第二排從左至右分別是模塊二和四。得到的五個(gè)模塊中都有與炎癥顯著性功能相關(guān)的注釋；模塊1中基因功能注釋到炎癥、增殖、凋亡；幾個(gè)模塊里還有關(guān)于侵襲轉(zhuǎn)移的功能注釋。其中多個(gè)功能有重復(fù)出現(xiàn)。如:taxis、regulation of developmental process、multi-organism cellular process。 通 過(guò)GO注釋的模塊功能與免疫反應(yīng)有關(guān)。

3 結(jié)論

通過(guò)本項(xiàng)目的初步研究，找到與胰腺癌發(fā)生密切相關(guān)的的五個(gè)模塊，而這些模塊又分別與炎癥、免疫、細(xì)胞增殖和凋亡等有關(guān)。表明mRNA和lncRNA通過(guò)多種途徑參與胰腺癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，在多個(gè)模塊中發(fā)現(xiàn)lncRNA00670與胰腺癌密切相關(guān)。隨著mRNA和lncRNA研究技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，利用生物信息學(xué)分析將會(huì)發(fā)掘更多的功能性mRNA和lncRNA，為診斷和治療胰腺癌等惡性病疾病提供新方向。

圖6 GO功能富集注釋

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