酸性氧化電位水對銅綠假單胞菌的殺菌機制研究

趙凱麗，李武平，張曉娜，王 剛，莊玉晨

(1. 第四軍醫大學西京醫院，陜西 西安 710032; 2. 第四軍醫大學西京皮膚醫院，陜西 西安 710032)

·論著·

酸性氧化電位水對銅綠假單胞菌的殺菌機制研究

趙凱麗1，李武平1，張曉娜1，王 剛2，莊玉晨2

(1. 第四軍醫大學西京醫院，陜西 西安 710032; 2. 第四軍醫大學西京皮膚醫院，陜西 西安 710032)

目的 探討酸性氧化電位水(EOW)對銅綠假單胞菌的殺菌機制。方法 以銅綠假單胞菌作為研究對象，從蛋白質滲漏，核酸和細胞膜鈣離子通透性等方面對EOW的殺菌機制進行研究，同時以2%戊二醛作為陽性對照組，以生理鹽水(NS)作為陰性對照組。結果 以EOW、2%戊二醛對銅綠假單胞菌作用30 s殺滅率>99.99%，作用60 s殺滅率可達100.00%。EOW、NS、2%戊二醛作用銅綠假單胞菌60 s后，經BCA法檢測蛋白滲漏，分別為(96.00±7.42)、(94.15±7.49)、(216.97±10.35)μg/mL，總體比較，差異有統計學意義(F=613.20，P<0.01)，2%戊二醛組高于EOW組、NS組；蛋白滲漏量不隨作用時間增加而改變(均P>0.05)。隨機多態性擴增DNA電泳圖譜顯示，EOW組與NS組均在500～1 000 kb間顯示亮度較高的密集條帶，2%戊二醛組無擴增條帶。EOW及2%戊二醛作用后鈣離子熒光強度均低于NS組。結論 EOW可能的殺菌機制是使銅綠假單胞菌細胞膜通透性受到一定程度的損傷，致使 Ca2+泄漏，但未能造成蛋白質泄漏，對其核酸損傷作用不明顯，DNA可能并非EOW殺菌靶點。

酸性氧化電位水；戊二醛；銅綠假單胞菌；殺菌機制；蛋白質泄漏；核酸；細胞膜通透性

[Chin J Infect Control，2017，16(1)：41-45]

酸性氧化電位水(electrolyzed oxidizing water，EOW)自1987年由日本研發問世后，其以安全、高效、環保等優點，在抗感染方面，包括國內外醫療，食品等領域均發揮了顯著效果。以往對于EOW殺菌機制的研究主要側重于某一理化性質，認為EOW中起主導作用的殺菌因素包括低酸性，高氧化還原電位ORP，活性氧以及有效氯[1]，其中有效氯起主導作用。EOW 使細菌胞壁皺縮降解，進而胞質內蛋白質變性酶失活[2]；抑制了細胞呼吸作用，降低了細胞膜上的Na+/K+-ATP 酶活性，導致細胞內大分子物質泄漏[3]。關于EOW殺菌機制尚無統一定論，存在爭議，還需進一步深入研究。本實驗以銅綠假單胞菌作為研究對象，從蛋白質滲漏，核酸和細胞膜鈣離子通透性等方面對EOW的殺菌機制進行研究，同時以2%戊二醛作為陽性對照組，以生理鹽水(normal saline，NS)作為陰性對照組進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 銅綠假單胞菌ATCC 15442由第四軍醫大學附屬西京醫院檢驗科提供。EOW由酸性氧化電位水生成器日本圣太科(規格型號SONTECH-1000)生成，2%戊二醛購于山東利爾康有限公司，SX-610型筆式pH計和ORP檢測筆，有效氯檢測儀SJ/S-CL501C，天根細菌DNA提取試劑盒，天根BCA蛋白質定量試劑盒，隨機引物序列設計參照文獻[4]，為5’-AGCGGGCCAA-3’，由上海生工生物工程有限公司合成引物，普通 PCR儀MyCycler，cwbio2×Taq MasterMix購于北京康為世紀，碧云天生物技術Fluo-3 AM(鈣離子熒光探針)，酶標儀Model680，紫外分光度計DU-530。圖像處理采用image J軟件。

1.2 中和劑鑒定試驗 試驗菌銅綠假單胞菌為ATCC 15442，EOW中和劑為1%硫代硫酸鈉，2%戊二醛中和劑為甘氨酸+吐溫100+卵磷脂，中和劑均用PBS配制后經高壓蒸汽滅菌，進行中和劑鑒定。根據2002版《消毒技術規范》試驗平行設置6組。

1.3 殺菌效果測定 取24 h細菌新鮮培養液，配制試驗用菌懸液，取 1 mL菌懸液加入至9 mL消毒劑中，混勻，分別作用60、120 s后，立即取1 mL混合液加入到9 mL中和劑中作用10 min，對照組用NS進行同樣操作。吸取0.2 mL采用平板傾注計數法進行菌落總數測定，TSA培養基37 ℃培養24 h后，進行菌落計數，試驗重復3次。

1.4 蛋白滲漏量測定

1.4.1 樣本制備 配制實驗用菌懸液，取4支無菌試管中分別加入0.5 mL菌懸液，試驗組分別加入4.5 mL EOW(pH=2.7)、2%戊二醛及NS，作用至預定時間后，分別經φ=0.22 μm微孔濾過膜濾過，取濾液備用。

1.4.2 二喹啉甲酸法(BCA法)標準蛋白配制及測定 參照天根BCA蛋白定量試劑盒說明書：(1)用NS稀釋標準品；(2)根據樣本數量按50∶1配制BCA工作液，充分混勻；(3)吸取25 μL BSA標準液和待測細菌濾液加入到96孔板；(4)每孔加入220 μL BCA工作液，混勻，加蓋37℃孵育30 min后冷卻至室溫，酶標儀檢測562 nm處吸光度。(5)以OD值為橫坐標，標準蛋白濃度為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線計算3組蛋白滲漏量。

1.5 對銅綠假單胞菌DNA的作用

1.5.1 對銅綠假單胞菌提純DNA的作用 DNA樣本制備：取24 h新鮮細菌培養液，參照天根細菌DNA基因組提取試劑盒說明書進行DNA提取。取1 μL 提純DNA，分別加入至9 μL EOW、2%戊二醛、NS中作用60 s，迅速加入至90 μL 中和劑混勻，作用10 min備用。

1.5.2 銅綠假單胞菌隨機多態性擴增 隨機引物5’-AGCGGGCCAA-3’，10 μL 反應體系：引物2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 1 μL，Taq MasterMix 6 μL；擴增條件：94℃ 2.5 min，變性94℃45 s，退火41℃ 1 min，延伸72℃ 1.5 min，共30個循環，72℃ 5 min，擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 對銅綠假單胞菌細胞膜通透性的作用 制備菌懸液，取100 μL 分別加入至900 μL EOW、2%戊二醛及NS中混勻，作用60 s后取混合液100 μL 分別加入到900 μL 中和劑中作用10 min，每管避光加1 μL 熒光探針Fluo-3AM，使其終濃度5 μmol/L，震蕩混勻后置于37℃恒溫箱孵育45 min進行探針裝載，裝載完成后將各管離心8 000 r/min，3 min，棄上清后加入1 000 μL 無菌PBS緩沖液漂洗2次，進行激光共聚焦觀察。

2 結果

2.1 中和劑鑒定結果 中和劑鑒定結果顯示，第1組無菌生長，第2組菌落生長較第1組多，第3、4、5組菌落生長數比較，差異無統計學意義，第6組無菌生長。EOW組間菌落數誤差率為9.112%，2%戊二醛組間菌落誤差率為9.086%，中和劑鑒定合格。見表1。

2.2 殺菌試驗結果 以EOW(pH=2.7，有效氯含量40 mg/L)及2%戊二醛對銅綠假單胞菌標準菌株ATCC 15442作用30 s殺滅率>99.99%，作用60 s殺滅率可達100.00%，兩種消毒劑對銅綠假單胞菌殺菌效果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。NS對照組平均菌落數為20.20×106CFU/mL。

表1 不同組別中和劑鑒定結果(平均回收菌落數，×106CFU/mL)

Table 1 Identification results of neutralizer in different groups (Average number of recovered bacteria, ×106CFU/mL)

實驗分組EOW組2%戊二醛組第1組:消毒劑+菌懸液00第2組:(消毒劑+菌懸液)+中和劑7.99.2第3組:中和劑+菌懸液21.920.1第4組:(消毒劑+中和劑)+菌懸液18.621.7第5組:稀釋液+菌懸液17.316.9第6組:稀釋液+中和劑+培養基00

2.3 蛋白質滲漏測定結果 EOW、NS、2%戊二醛作用銅綠假單胞菌60 s后，經BCA法檢測蛋白滲漏，分別為(96.00±7.42)、(94.15±7.49)、(216.97±10.35)μg/mL，總體比較，差異有統計學意義(F=613.20，P<0.01)，2%戊二醛組高于EOW組、NS組。蛋白滲漏量不隨作用時間增加而改變(均P>0.05)。見表2、圖1～2。

表2 銅綠假單胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用不同時間后蛋白滲漏情況±s，μg/mL)

***：表示差異有統計學意義；ns：表示差異無統計學意義

圖1 銅綠假單胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用60 s后蛋白滲漏情況(μg/mL)

Figure 1 Protein leakage ofP.aeruginosaafter 60-second contact with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS(μg/mL)

圖2 銅綠假單胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用不同時間后蛋白滲漏情況

Figure 2 Protein leakage ofP.aeruginosaafter different contact time with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS(μg/mL)

2.4 對銅綠假單胞菌DNA的作用結果 EOW作用于銅綠假單胞菌DNA 60 s后，經擴增后于電泳檢測兩組DNA指紋圖譜，均在500～1 000 kb間顯示亮度較高的密集條帶。2%戊二醛作用后的銅綠假單胞菌DNA經PCR擴增電泳檢測無DNA條帶顯示。見圖3。

2.5 對銅綠假單胞菌作用后細胞膜鈣離子通透性測定結果 激光共聚焦結果顯示，EOW、2%戊二醛、NS處理后銅綠假單胞菌鈣離子熒光強度分別為40.50±4.42、47.63±3.77、1 903.75±16.12，總體比較，差異有統計學意義(F=82 580，P<0.01)，EOW組、2%戊二醛組均低于NS組，僅散在分布于各視野。見圖4。

EOW：為酸性氧化電位水；GLU：為2%戊二醛；NS：為生理鹽水；編號1、2、3為三組樣本：M為分子量為2 000kb的DNAmarker

圖3 EOW、2%戊二醛及NS對銅綠假單胞菌DNA作用后PCR擴增電泳圖譜

Figure 3 Electrophoresis map of PCR amplifiedP.aeruginosaDNA after contact with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS

a:EOW;b:2%戊二醛;c:NS

3 討論

3.1 EOW對銅綠假單胞菌胞內蛋白質滲漏的作用情況 EOW獨特的理化性質(pH<3，高ORP>1 100 mv，低濃度有效氯30～60 mg/L)使其殺菌能力非單一因素所決定，文獻[5]已報道中性EOW滅菌效果未發生改變，而有效氯濃度改變很大程度影響了其滅菌效果。氯可氧化細菌-SH基，次氯酸鹽可與胞質成分作用形成氮氯復合物干擾細胞代謝，而胞內物質的滲漏與細菌致死并無確切聯系[6]。銅綠假單胞菌屬革蘭陰性細菌，其細胞壁的外膜及細胞膜上均鑲嵌有蛋白質大分子，并且胞膜內包裹的細胞質由水、蛋白質、脂類、核酸及少量糖和無機鹽組成，若EOW使其細胞外膜破裂，則細菌濾液中會有蛋白質滲漏[1]，通過BCA法檢測的蛋白質滲漏量應高于對照組，結果顯示，EOW作用60 s后與NS組相比蛋白滲漏差異無統計學意義，而2%戊二醛組蛋白滲漏高于EOW及NS組，為排除作用時間對結果的影響，于不同作用時間后經BCA測定，結果顯示，3組蛋白質滲漏量未呈現出隨時間改變趨勢，推測EOW的殺菌機制可能不是使細菌細胞壁細胞膜破裂蛋白大分子滲漏。

3.2 EOW對銅綠假單胞菌核酸的作用情況 隨機擴增多態性DNA，無需專門設計特定引物，由于隨機引物在較低的復性溫下能與基因組DNA非特異性的結合，當相鄰兩個引物間DNA小于2 000 bp時，就能得到擴增產物，可檢測由于堿基發生缺失、插入、突變、重排等所引發的DNA多態性[7]。戊二醛的殺菌機制是對細菌蛋白質和核酸的烷化作用，烷化后G(鳥嘌呤)發生改變導致和T錯配；G結構破壞；DNA不能復制，且DNA斷裂，因此經2%戊二醛作用后的銅綠假單胞菌DNA無法進行PCR，而EOW作用后DNA指紋圖譜與對照組無差異，推測EOW未使銅綠的DNA發生斷裂損傷。此結論與以往文獻[8]報道，EOW作用后細菌DNA 的限制性片段多態性并未改變相符。DNA損傷是一個極其復雜的過程，損傷類型包括點突變、缺失、插入、倒位或轉位、雙鏈斷裂等，更進一步判斷DNA損傷類型需進行DNA序列檢測。

3.3 EOW對銅綠假單胞菌細胞膜通透性的作用情況 細菌的生命狀態與其細胞膜通透性密切相關，反映膜通透性改變的指標包括細胞內Ca2+、K+、Na+、Mg2+、核酸、蛋白質等。已證實EOW將造成細菌超微結構改變，細胞壁皺縮、酶失活、胞質內DNA及K+滲漏[9]。Ca2+作為重要的第二信使，調節著細胞功能，其濃度變化可預示細菌的存亡。Fluo-3 AM是一種新型高度特異性Ca2+熒光指示劑，只有進入細胞后經非特異性酯酶脫去AM酯成為脂溶性Fluo-3后留在細胞內與游離Ca2+結合在激發光激發后被檢測到，其熒光強度與Ca2+濃度成正比。激光共聚焦結果顯示，EOW和2%戊二醛使得銅綠假單胞菌胞內Ca2+含量低于NS，推測EOW作用后銅綠假單胞菌細胞膜Ca2+通道發生改變，引起Ca2+外漏，最終導致或促進細菌死亡。

綜上所述，細菌細胞壁及核酸并非EOW的主要作用靶點，細胞膜通透性改變導致重要離子外漏是導致細菌死亡的原因之一。此外，可能的殺菌機制包括干擾細菌代謝，使酶失活等還有待進一步研究。

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(本文編輯：文細毛)

Bactericidal mechanism of electrolyzed oxidizing water againstPseudomonasaeruginosa

ZHAOKai-li1,LIWu-ping1,ZHANGXiao-na1,WANGGang2，ZHUANGYu-chen2

(1XijingHospital，FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032，China； 2XijingSkinHospital，FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Objective To investigate the bactericidal mechanism of electrolyzed oxidizing water (EOW) againstPseudomonaaeruginosa(P.aeruginosa).Methods Bactericidal mechanism of EOW againstP.aeruginosawas studied through intracellular protein leakage, nucleic acid,and cell membrane calcium ion permeability, 2% glutaraldehyde was used as positive control group, and normal saline (NS) was used as negative control group.Results The killing rates of EOW and 2% glutaraldehyde toP.aeruginosawere both>99.99% with 30-second contact time, and 100.00% with 60-second contact time. After 60-second contact with EOW, NS, and 2% glutaraldehyde，the protein leakage ofP.aeruginosadetected by bicinchoninic acid (BCA) were (96.00±7.42),(94.15±7.49), and (216.97±10.35)μg/mL, respectively, difference was significant(F=613.20，P<0.01)，2% glutaraldehyde group was higher than EOW group and NS group; protein leakage did not change with the increase of contact time(allP>0.05). Electrophoretogram of random amplified polymorphic DNA showed high intensity dense band between 500-1000 Kb in EOW group and NS group, while 2% glutaraldehyde group was without amplified bands. The fluorescence intensity of calcium ion of EOW group and 2% glutaraldehyde group were both lower than that of NS group.Conclusion Bactericidal mechanism of EOW may be due to the damage of membrane permeability ofP.aeruginosa, which causes Ca2+leakage, but fails to cause protein leakage, the damage to nucleic acid is not obvious, DNA may not be a bactericidal target of EOW.

electrolyzed oxidizing water; glutaraldehyde;Pseudomonasaeruginosa; bactericidal mechanism; protein leakage; nucleic acid; cell membrane permeability

2016-06-01

趙凱麗(1991-)，女(回族)，甘肅省天水市人，碩士研究生，主要從事重癥監護與醫院感染研究。

李武平 E-mail:liwuping@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.01.009

R187

A

1671-9638(2017)01-0041-05