腦缺血預處理對大鼠蛛網膜下腔出血后細胞凋亡的影響

羅仁國 段 劫 趙 龍 熊 平 段軍偉

（川北醫學院附屬醫院神經外科，四川南充 637000）

腦缺血預處理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）即一次或多次短暫的非致死性腦缺血可誘導缺血腦組織對今后一定時間段的腦缺血損傷產生耐受性。一系列相關實驗已證實短暫缺血預處理可以激發或動員機體的潛在防護能力，對隨后的嚴重缺血缺氧產生強大的保護作用[1]。動脈瘤性蛛網膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，SAH）具有高致死性及高致殘性，有12.4%的患者在就診前即已死亡，多達40%～60%的患者在首次出血的48 h內死亡，而腦組織缺血缺氧在疾病的發生發展過程中扮演了重要作用。本研究擬通過對實驗性SAH大鼠進行缺血預處理，觀察SAH大鼠神經元細胞凋亡及神經行為學的變化情況，探討缺血預處理在SAH中的作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

本研究采用Sprague-Dawley成年雄性大鼠（300 g,川北醫學院實驗動物中心）。所有大鼠于24℃下12 h明暗周期下飼養，操作程序均按動物使用和管理委員會的當地指南進行，并按照中國國家動物福利法給予處死。共78只大鼠隨機分為6組：A組（n=6，正常對照組）；B組（n=18，假手術組）；C組（n=18，缺血預處理組）；D組（SAH組）；E組（n=18，缺血預處理1天后SAH組）。除A組外，其余各組再根據實驗終止時間不同分為1、3、7 d三個亞組，每亞組6只。

1.2 缺血預處理操作方式

參照經典四血管阻斷法加以改良后建立大鼠全腦缺血預處理模型。實驗動物在術前一天禁食，術前6 h禁飲。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔內注射麻醉。大鼠取仰臥位，固定四肢及頭部，于頸部鎖骨上正中線切開皮膚約15 mm，鈍性分離皮下組織，游離暴露雙側頸總動脈和鎖骨下動脈起始部，用無損傷動脈夾夾閉180 s。預處理后用稀釋慶大霉素鹽水沖洗創面并逐層縫合。動脈夾閉期間，觀察實驗大鼠對疼痛刺激的反應、瞳孔對光反射及翻正反射，以判斷腦缺血模型是否成功。入選大鼠應保證瞳孔對光反射消失，對疼痛刺激無反應，翻正反射消失。假手術組只分離動脈而不夾閉。

1.3 缺血預處理后蛛網膜下腔出血模型的建立

缺血預處理3 min后3 d行蛛網膜下腔出血模型法造模。采用視交叉池注血法建立蛛網膜下腔出血模型。麻醉Sprague-Dawley雄性大鼠。給大鼠插管，維持呼吸道通暢。用電熱墊維持大鼠體溫為（37±0.5）℃。采用腦立體定向方法導入定點于中線前囪前6.5 mm處，與垂直面呈30°角。使穿刺針頭的孔口向右，針頭落下使針尖直達至顱底、視交叉前2～3 mm處。在股動脈穿刺取血，抽取250 μL血液，3 min內勻速注射入視交叉前池。此后，保持大鼠麻醉狀態約1 h，使之從顱內刺激中逐漸恢復。于每只大鼠解剖取腦時再次證實SAH。在觀察期間內，定時監測大鼠生命體征。

1.4 實驗大鼠行為學改變觀察及評分

分別于預定時間對各組大鼠按照Longa評分[2]標準進行神經行為學評分。活動正常且無神經功能缺損者記0分；出現豎毛或輕度運動低下者記0.5分；不能完全伸直前肢或后肢者記1分；肢體癱瘓或行動不協調、追尾者記2分；不能站立或行動時向一側傾倒者記3分；無自發性運動或有明顯意識障礙者記4分。

1.5 神經細胞凋亡的檢測

大鼠造模術后按相應時間段快速斷頭處死，完整取出腦組織，并保持蛛網膜完整性。經10%福爾馬林固定、漂洗、脫水、透明、石蠟包埋后，在視交叉后1 mm及4 mm處冠狀切開鼠腦（切片包含腦干和基底動脈）。切片進行TUNEL染色，采用雙盲法在400倍光學顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1區神經元細胞凋亡率（TUNEI染色細胞陽性率）。海馬CA1神經元細胞凋亡率=海馬CA1區TUNEI染色陽性細胞數量/海馬CA1區神經元細胞數量*100%。切片中正常神經元細胞TUNEL染色呈藍色，胞核相對較大，形態大小較一致。凋亡神經元細胞TUNEL染色呈棕色，形態呈濃縮或點片狀，不規則，大小不一致。

1.6 統計學處理

應用SPSS 16.0 統計學軟件進行資料分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組均數比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，采用SNK法進行兩兩比較；計數資料比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學觀察及神經行為評分

D組及E組實驗大鼠出現不同程度的行為異常，可表現為納差、反應遲鈍、自潔能力差、毛發雜亂、自主運動減少、頸項強直，部分大鼠出現意識障礙、肢體癱瘓、抽搐甚至角弓反張。大鼠神經行為學異常以SAH后的1、3 d最為明顯，后逐漸緩解。D組神經行為學評分最高，與其他各組相比，差異有明顯的統計學意義（P＜0.05）；E組各時間點神經行為學評分均較D組低，差異有統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組間實驗大鼠海馬CA1區神經元細胞凋亡率的檢測

A，B，C組海馬神經元細胞未見或僅有極少量TUNEL染色陽性凋亡細胞；D，E，F組海馬神經元細胞出現明顯的凋亡現象，其中以SAH后第3天時最為突出。各亞組實驗大鼠海馬神經元細胞凋亡率見表2。A，B，C各亞組實驗大鼠海馬神經元細胞凋亡率無統計學差異（P＞0.05）。各時間點E組神經元凋亡率均低于D組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。

3 討論與結論

蛛網膜下腔出血是多種病因引起的腦底部或腦、脊髓表面血管破裂導致急性出血性腦血管疾病，血液直接流入蛛網膜下腔，又稱原發性或自發性SAH。約90%的自發性蛛網膜下腔出血由顱內動脈瘤破裂引起，由于出血迅速，可短期內引起顱內壓急劇升高，導致嚴重的腦損害，多達40%～60%的患者在首次出血的48 h內死亡[3]。其腦損傷機制既包括早期腦損害，又包括遲發性缺血性損害，在腦保護藥物、手術技巧、手術策略等研究相同的條件下，疾病的預后主要由腦組織缺血缺氧能否得到有效干預有關。

表1 各亞組實驗大鼠相應時間段的神經行為學評分值表（x±s）

表2 各組大鼠海馬CA1區神經元細胞凋亡率（x±s）

缺血預處理由Murry[4]在心肌缺血實驗研究中首先發現。報道指出，通過亞致死性的短暫缺血處理，誘導缺血組織產生內源性保護機制，可以使機體在一定程度上減輕再次發生的缺血性損傷。隨后Kitagawa[5]等用沙土鼠全腦缺血模型實驗證實了通過腦缺血預處理也可誘發腦組織產生缺血耐受現象。目前，腦缺血預處理的研究多采用的是單次或重復短暫缺血來觀察隨后致死性缺血所引起的腦損傷情況。研究表明，預處理的效應可表現為早期保護效應和延遲保護效應，早期保護效應發生在預處理后數小時內，主要與腺普受體激活和鉀通道開放相關；延遲保護效應多在預處理后2～4 d內達到高峰[6，7]。因此，我們在本實驗中在缺血預處理3 d后進行蛛網膜下腔出血建模。實驗結果顯示：D組神經行為學改變評分最高，與A，B，C組比較有統計學意義（P＜0. 05），說明采用視交叉池注血成功建立了SAH模型，且大鼠出現了明顯的神經行為學改變，這種變化在造模后3 d最為明顯，7 d時有所恢復；與D組相比，E組大鼠雖然也出現了神經功能變化，但其程度在1、3、7 d亞組均較D組輕，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明缺血預處理可以減輕實驗大鼠SAH后神經功能障礙，對SAH后腦損害有保護作用。對于其神經保護機制，我們觀察并比較了海馬區神經元凋亡情況。結果顯示，3 min缺血預處理即可造成海馬區神經元出現凋亡現象；D組SAH后大鼠海馬CA1區正常神經元細胞密度較低，神經細胞凋亡明顯增加，而E組大鼠海馬CA1區雖然也可觀察到明顯的掉網現象，但是凋亡率較D組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗結果提示腦缺血預處理可以顯著降低海馬CA1區神經元凋亡。

綜上，我們通過動物實驗驗證了缺血預處理對SAH大鼠缺血腦組織有明顯的保護作用，可以明顯改善神經功能障礙程度，其機制與增加腦組織對缺氧的耐受性，減少神經細胞凋亡有關。

[1] 王國峰，劉伯芹，趙玉芳，等. 缺血預處理對腦缺血大鼠血管內皮生長因子表達及微血管密度變化的影響[J]. 中國卒中雜志，2011，6（11）：869-875.

[2] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20：84-91.

[3] 楊彬彬，唐曉平，趙龍，等.高壓氧對大鼠蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣的影響[J].中華臨床醫師雜志（電子版），2016，10（7）：974-977.

[4] Murry CE，Jenings RS，et al.Preconditioning with ischemia dalay of lethal cell injury in myocardium[J].Circulation，1986，74（5）：1124-1127.

[5] Kitagawa K，Matsumoto M，Masafumi Tagaya，et al."Ischemic tolerance" phenomenon found in the brain[J].Brain research，1990，528：21-24.

[6] Valentim LM，Geyer AB，Tavares A，et al.Effects of global cerebral ischemia and preconditioning on heat shock protein 27 immuno content and phosphorylation in rat hippocampus[J].Neuronscience，2001，107：43-44.

[7] 李建民，趙雅寧，安超旺，等.腦缺血預處理對沙鼠前腦缺血再灌注后HSP70表達水平及學習記憶能力的影響[J]. 第二軍醫大學學報，2010，31（1）：55-59.