熱補針法對寒證類風濕關節炎模型家兔滑膜組織代謝物的影響

杜小正 袁博 王金海 方曉麗 張星華 田亮 張婷卓 李興蘭 曾華宗

摘要：目的 通過測定寒證類風濕關節炎（RA）模型家兔滑膜組織內源性代謝物，探討熱補針法治療RA的特異性機制。方法 采用卵蛋白誘導聯合低溫冷凍法復制寒證RA模型。將40只清潔級青紫藍家兔隨機分為正常組、模型組、平補平瀉組、捻轉補法組、熱補針法組，每組8只。除正常組和模型組外，其余各組分別施以平補平瀉、捻轉補法、熱補針法針刺“足三里”，1次/d，留針30 min，連續7 d。干預結束后分離家兔膝關節滑膜組織，應用氣相色譜-四級桿飛行時間質譜采集各組滑膜代謝物譜圖，利用主成分分析和偏最小二乘判別分析對數據進行統計。結果 與正常組比較，模型組家兔滑膜組織代謝物變化主要體現于三羧酸循環、糖類及脂肪酸代謝相關物質增高（P<0.05）；與模型組比較，各針刺組家兔滑膜組織代謝物變化主要體現于上述各種代謝相關物質降低（P<0.05），且熱補針法組三羧酸循環與糖代謝相關物質明顯低于平補平瀉組和捻轉補法組（P<0.05）。結論 熱補針法治療RA的特異性體現在對三羧酸循環及糖代謝通路的調控。

關鍵詞：熱補針法；類風濕關節炎；滑膜組織；代謝組學；氣相色譜-質譜法；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.015

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0055-05

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎為主的慢性自身免疫性疾病，該病病程遷延、反復發作，對患者的生活造成嚴重影響。針灸療法具有抗炎、免疫調節等作用[1-3]，對RA具有確切的臨床療效[4-5]。熱補針法是鄭魁山教授簡化燒山火手法和進火法而形成的一種復式手法，具有補益正氣、溫陽散寒之功用。課題組前期研究表明，熱補針法治療RA在鎮痛方面具有相對特異性[6-9]，但這些初步研究尚不能體現針灸多靶點、多途徑、多層次、類似于網絡結構的作用特點，缺乏對針刺后機體產生的全部生物信息的綜合分析。

代謝組學是一門新興的系統生物學，通過考察生物體系在外因刺激下其代謝路徑及代謝產物的變化，從系統生物學角度研究機體發病及治療機制的新技術[10-11]。該研究手段的優勢與針灸作用特點甚相吻合。為了進一步深入研究熱補針法治療RA的特異性機制，課題組前期以寒證RA模型家兔為載體，對家兔尿液內源性代謝物進行了分析[12]。本實驗進一步觀察熱補針法干預對家兔模型關節滑膜組織代謝物的影響，從系統生物學角度探討熱補針法治療RA的特異性機制。

1 材料與方法

1.1 動物

2～3月齡清潔級健康青紫藍家兔40只，雌雄各半，體質量（2.5±0.5）kg，蘭州生物制品研究所，動物許可證號SCXK（甘）2012-0001。飼養于溫度（20±2）℃，相對濕度（50±10）%，每日光照時間12 h，自由進食飲水。

1.2 針具、主要試劑與儀器

針灸針（華成牌，蘇州東邦醫療器械有限公司）。卵蛋白干粉（批號A5253-250G）、弗氏完全佐劑（批號F5881），Sigma公司。甲醇、吡啶，國藥集團；尿素酶、甲氧胺鹽酸吡，Sigma公司。Agilent GC/MS系統、毛細管色譜柱，J&W; Scientific公司。

1.3 分組及造模

家兔適應性飼養7 d，隨機分為正常組、模型組、平補平瀉組、捻轉補法組、熱補針法組，每組8只。采用卵蛋白誘導聯合低溫冷凍進行RA寒證模型復制[13-14]。實驗正式開始前3 d，剃去家兔背部肩胛骨間的毛。將4 mg/mL卵蛋白溶液與等量弗氏完全佐劑混勻，充分震蕩成乳化劑，2%碘酒、75%乙醇消毒肩背部均勻選定的6個點，每點皮下注射0.2 mL。14 d后以相同方式、相同劑量重復皮下注射1次。第2次免疫后6 d，剃去家兔雙后腿膝關節周圍的毛，2%碘酒、75%乙醇消毒雙膝關節，關節內注入20 mg/mL卵蛋白生理鹽水溶液0.4 mL。24 h內膝關節出現紅腫觸痛，表明模型復制成功。成模后第2日，乙醇消毒兩后腿足，上、下、左、右圍置冰袋，溫度降至-20～-25 ℃冷凍1.5 h，45 ℃溫水復溫5 min。冷凍后14 d，家兔表現為精神萎靡不振，兩后肢匍伏跛行，膝關節腫脹、周徑明顯大于正常組，局部青紫、皮溫不高，表示成功建立RA寒證模型。

1.4 針刺方法

先將家兔固定，選取后腿“足三里”[15]。各針刺組分別施以相應針法。熱補針法操作參照《鄭氏針灸全集》[16]：左手拇指緊按穴位，右手持針刺入穴內8～12 mm，針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續捻按5次；針下沉緊后針尖拉著有感應的部位，連續重插輕提5次；拇指再向前連續捻按5次，反復操作1 min；最后使針下沉緊，留針30 min。平補平瀉法、捻轉補法操作參照《刺法灸法學》[17]。平補平瀉法：針刺得氣后，前后均勻捻轉，不單向捻轉，指力均勻，角度180～360?，頻率60～90 r/min，反復操作1 min。捻轉補法：針刺得氣后，小幅度前后捻轉針體（角度180～360?，頻率60～90 r/min），拇指向前左轉時用力重、指力沉重向下，拇指向后右轉還原時用力輕，反復操作1 min。每日1次，每次留針30 min，連續7 d。

1.5 樣本采集

針刺干預結束后，耳后緣靜脈注射空氣處死家兔，分離各組家兔雙側膝關節滑膜組織，于凍存管內置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.6 樣品衍生化處理

室溫解凍后，取100 μL樣本于1.5 mL EP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣品∶甲醇=1∶4，渦旋30 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取200 μL上清液，轉入進樣小瓶中待測。將進樣小瓶置于溫和氮氣下吹干，加入30 μL甲氧胺吡啶（20 mg/mL）溶液，劇烈震蕩30 s，37 ℃肟化反應90 min，取出后加30 μL BSTFA（含1%TMCS）進行衍生，70 ℃反應60 min，室溫靜置30 min備檢。

1.7 氣相色譜-質譜條件

進樣口溫度280 ℃，EI離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣（純度>99.999%）作為載氣，不分流進樣，進樣量1.0 μL。升溫程序為：初始溫度80 ℃，維持2 min，10 ℃/min速度升至320 ℃，維持6 min。采用全掃描模式進行質譜檢測，質譜檢測范圍為50～550 m/z。采用隨機順序進行連續樣本分析，避免儀器信號波動所造成的影響。

1.8 統計學方法

在R軟件平臺下采用XCMS軟件對GC/MS數據進行預處理，并在Excel2010軟件中進行后期編輯，將最終結果組織為二維數據矩陣，包括變量（保留時間、質荷比）、觀察量（樣本）和峰強。然后將所有數據歸一化到總信號積分。將編輯后的數據矩陣導入SIMCA-P13.0進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），最后獲得差異物質。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原始色譜圖的可視化檢查

每組樣本的離子流色譜圖（TIC）見圖1。儀器的保留時間重現性良好，儀器穩定，因而提高了儀器分析和數據結果的可靠性。

結果顯示，模型組滑膜組織代謝物變化較正常組主要體現于三羧酸循環、糖類及脂肪酸代謝的代謝物升高（P<0.05）；各針刺組代謝物變化較模型組主要體現于脂肪酸代謝各種代謝相關物質降低（P<0.05），且各針刺組間差異無統計學意義（P>0.05），各針刺組干預后三羧酸循環、糖類代謝相關代謝物下調，且熱補針法組三羧酸循環與糖代謝相關物質如檸檬酸、烏頭酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸、乳酸、牛磺酸明顯低于平補平瀉組和捻轉補法組（P<0.05）。

3 討論

RA是一種以關節滑膜炎為主要病理改變的自身免疫性疾病，滑膜炎是RA中重要的病理改變，與血液、尿液比較，關節滑膜組織代謝物信息的變化可能更能準確、靈敏地反映RA的發病機制。有研究發現，在RA機體內能量代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、葡萄糖代謝等發生了變化[18-20]，本實驗發現RA與三羧酸循環、糖類及脂肪酸代謝相關，與上述研究相符，表明RA的發病機制涉及途徑廣、層次多等復雜的網絡系統。因此，從現代醫學角度而言，其發病機制與針灸多靶點、多途徑、多層次、類似于網絡結構的整體作用特點亦甚相符。

自由基理論認為，其親核氨基可與水分子作用產生大量的自由基，造成細胞膜和線粒體等氧化應激性損傷[21]，自由基的增多，會引起脂質氧化代謝紊亂、線粒體損傷等一系列連鎖反應，最終造成細胞膜的損傷，癸二酸、壬二酸、亞麻酸作為不飽和脂肪酸，其含量升高就是脂質過氧代謝的表現，本實驗結果驗證了這一說法。線粒體的損傷會引發三磷酸腺苷（ATP）的合成障礙。本實驗發現，模型組琥珀酸、檸檬酸、烏頭酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸的含量增加，這些物質均是三羧酸循環的中間產物，三羧酸循環是糖的有氧代謝的主要途徑，它與催化糖的有氧分解等相關的酶分布在線粒體基質中，線粒體是細胞內氧化磷酸化和合成ATP的主要場所，它為細胞的活動提供了能量。因此，這些代謝物的異常變化反映了線粒體功能的損害[22]。

細胞膜的損傷可誘發炎癥反應，RA是一種以滑膜炎為主的疾病，有人認為與RA相關的白細胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6等促炎性細胞因子[23-24]具有多種促炎作用，可刺激前列腺素E的產生，而前列腺素作為花生四烯酸的代謝產物，其含量在RA發生后含量會增加，從而使其前體物質花生四烯酸的含量降低。本實驗結果顯示，模型組花生四烯酸含量較正常組下降、前列腺素E2甲酯升高，與上述描述相一致。

正常生理狀態下，葡萄糖在無氧情況下，經糖酵解途徑分解成乳酸，并釋放出少量能量，乳酸成為這一糖酵解過程的最終產物；牛磺酸是機體非必需氨基酸之一，是體內一種重要的含硫氨基酸，它一般以游離形式存在于人及動物組織細胞和體液中，?；撬釁⑴c糖代謝的調節，加速糖酵解。本實驗發現模型組乳酸和?；撬岷枯^正常組增加，提示RA滑膜組織糖酵解活性增強，這與文獻報道一致[25]。

RA屬中醫學“痹證”范疇。正氣虛弱是RA發病的內因，風寒濕邪侵犯是外因，風寒濕邪乘虛侵入四肢關節筋骨，陽氣虛不能驅邪外出，邪氣黏滯纏綿，閉阻經絡，發為此病。因此，中醫治療須標本同治，在祛散邪氣的同時兼顧溫補陽氣，即為“陽氣并則陰凝散”。熱補針法是鄭魁山教授臨床治療RA的經驗結晶，具有補益正氣、溫陽散寒的作用。從中醫角度而言，熱補針法的功用與RA的病機特點相吻合。

綜上，針刺干預后參與脂肪酸代謝的上述物質普遍下調，且各針刺組間差異無統計學意義（P>0.05），提示針刺對RA具有抗氧化損傷及抗炎的作用；針刺干預后參與三羧酸循環及糖代謝的上述代謝物均顯著降低（P<0.05），尤以熱補針法組下調明顯（P<0.05），說明熱補針法可能通過修復線粒體功能損傷（ATP合成受限）、改善糖酵解來調節RA的三羧酸循環及糖代謝。

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（收稿日期：2016-02-03）

（修回日期：2016-03-01；編輯：華強）