LASS2-3'-非翻譯區rs8444單核苷酸多態性與膀胱癌易感性的相關性研究*

陳玉錦 王海峰 顏汝平 柯昌興 丁明霞 欒婷 鄒仁超 王劍松

·臨床研究與應用·

LASS2-3'-非翻譯區rs8444單核苷酸多態性與膀胱癌易感性的相關性研究*

陳玉錦①②王海峰①顏汝平①柯昌興①丁明霞①欒婷①鄒仁超①王劍松①

目的：探討人源性長壽保障基因2（Homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2）-3'-非翻譯區（UTR）單核苷酸多態性與中國云南地區膀胱癌人群之間的相關性。方法：選擇2011年1月至2015年1月在昆明醫科大學第二附屬醫院就診且經病理學確診的105例膀胱癌作為膀胱癌組、100例非膀胱癌作為對照組進行病例對照研究，對兩組患者的膀胱組織進行基因擴增和測序，分析研究LASS2-3'-非翻譯區單核苷酸多態性與膀胱癌之間的相關性。結果：在LASS2-3'-非翻譯區僅發現1個單核苷酸多態性位點rs8444，經χ2檢驗和Logistic回歸分析顯示，膀胱癌組和對照組rs8444T/C等位基因頻率及基因型分布差異具有統計學意義（χ2=10.267，P=0.006；χ2=10.634，P=0.001）。與攜帶T等位基因或TT基因型相比，攜帶C等位基因或CC基因型的個體發生膀胱癌的風險顯著降低（OR=0.489，95%CI為0.309～0.772，P=0.002；OR=0.258，95%CI為0.081～0.827，P=0.023），但與膀胱癌的TNM分期、病理分級和有否轉移無明顯相關性（P＞0.05）。結論：LASS2-3'-非翻譯區rs8444C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的發病風險，但與膀胱癌的TNM分期、病理分級和轉移情況無關。

LASS2 膀胱癌 多態性 單核苷酸

膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤之一，在全球男性惡性腫瘤中位居第6位，每年全球有近429 800例新發病例和165 100例死亡病例，不同地區膀胱癌的發病率可相差10倍［1］。根據中國癌癥登記中心數據，2011年中國膀胱癌發病率為7.68/105、死亡率為1.99/105，膀胱癌發病率與死亡率均居泌尿系統腫瘤前列［2-3］。人源性長壽保障基因2（Homo sapi?ens longevity assurance homologue 2，LASS2）位于染色體1q11，含有保守的TLC域和特定的HOX域，在促進癌細胞凋亡、抑制癌細胞侵襲及轉移中發揮著重要作用［4］。此前的研究結果［5］已證實，LASS2可明顯抑制膀胱癌細胞增殖，其表達水平與膀胱癌細胞株侵襲能力呈負相關，在膀胱癌的發生發展中扮演著抑癌基因的作用。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是最常見的基因遺傳變異，通過改變基因結構或表達量影響基因對機體的調控作用。目前有關LASS2基因多態性的研究較少［6］，尤其LASS2單核苷酸多態性與膀胱癌相關性的研究國內外鮮有報道。因此，本研究對膀胱癌患者的LASS2-3'-非翻譯區（LASS2-3'-UTR）進行測序分析，探討SNPs與膀胱癌之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2011年1月至2015年1月105例昆明醫科大學第二附屬醫院就診且確診為膀胱癌的患者，其中漢族90例、回族4例、白族3例、彝族3例、哈尼族2例、壯族1例、傣族1例、傈僳族1例。選取100例同期就診、經膀胱鏡檢查后病理確診的非膀胱癌患者作為對照組，包括73例慢性膀胱炎、15例膀胱息肉、7例膀胱憩室、2例乳頭狀膀胱炎、2例膀胱結核和1例膀胱平滑肌瘤，排除其他惡性腫瘤史、有明確膀胱癌家族史、以及前列腺特異抗原（PSA）＞4 ng/mL的前列腺增生的患者，其中漢族87例、回族6例、彝族3例、納西族1例、白族1例、哈尼族1例、苗族1例。所有膀胱癌患者均首次診斷為原發性膀胱移行細胞癌，并根據2009年國際抗癌聯盟（UICC）TNM分期標準（第7版）確定腫瘤的TNM分期，診療之前未經過其他治療。膀胱癌組和對照組所選對象均為長期居住于云南地區人群。所有的組織樣本一經采集立刻置于液氮中，隨后保存于-80℃超低溫冰箱。所有試劑均購自北京天根生化科技有限公司。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽屬知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 按照血液/組織/細胞基因組提取試劑盒中的操作說明對收集的臨床組織樣本進行全基因組DNA提取，將DNA濃度稀釋至20 ng/mL，-20℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈式反應（PCR） 應用Gene Bank檢索LASS2-3'-UTR序列，采用Primer Premer 5.0和Blast軟件設計并檢測LASS2-3'-UTR引物后，利用PCR混合液對總DNA進行擴增。LASS2上游引物為5'-CCAAAGCTGGACCAAGGCTA-3'；下游引物為5'-GCAAGGAAGGCATAAGAAAGACT-3'。PCR反應體系為25 uL，包括20 ng基因組DNA、1×PCR緩沖液及400 nM上下游引物。反應條件為95℃預變性0.5 min，95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃延伸5 min。

1.2.3 DNA測序 PCR擴增后的產物經過1.5%凝膠電泳檢測后，進行測序。

1.3 統計學處理

應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料使用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗分析；計數資料采用χ2檢驗分析，檢測納入樣本的人群是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。SNPs和膀胱癌風險之間的關系采用非條件Logistic回歸分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

膀胱癌組共納入了105例患者，平均年齡為（60.95±9.62）歲，漢族90例，男性82例；對照組共納入了100例患者，平均年齡為（62.45±11.18）歲，漢族87例，男性74例。兩組資料均以漢族為主，年齡、民族、性別差異無統計學意義（均P＞0.05），匹配性良好。

2.2 LASS2-3'-UTR基因序列分析

本研究對膀胱癌組與對照組患者的膀胱組織樣本進行PCR擴增和LASS2-3'-UTR序列測定和分析，并與Gene Bank檢索的LASS2-3'-UTR序列進行比對，結果顯示僅在基因片段的120～140 bp位置發現rs8444T/C這一SNPs位點，而片段中其他則為堿基保守序列（圖1）。

2.3 Hardy-Weinberg平衡法則的吻合度檢驗

膀胱癌組與對照組多態性位點的基因型觀察值與期望值檢測均符合Hardy-Weinberg平衡定律，吻合良好（P＞0.05），表明本研究對象來自大的群體，具有較好的代表性（表1）。

2.4 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因頻率和基因型與膀胱癌發生風險的關系

膀胱癌組和對照組LASS2-3'-UTR的rs8444位點T/C等位基因頻率及基因型分布差異具有統計學意義，膀胱癌組中攜帶C等位基因或CC基因型的比例均顯著低于對照組（均P＜0.01）。經年齡、性別校正后，Logistic回歸分析結果顯示，與攜帶T等位基因或TT基因型相比，攜帶C等位基因或CC基因型者膀胱癌發生風險顯著降低；攜帶TC基因型者較攜帶TT基因型者膀胱癌發生風險降低，但差異無統計學意義（表2）。

圖1 LASS2-3'-UTR測序結果Figure 1 Sequencing result for the SNP in LASS2-3'-UTR

表1 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C基因型分布和等位基因頻率分布Table 1 T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 in LASS2-3'-UTR

表2 LASS2-3'-UTR的rs8444多態性與膀胱癌的相關性Table 2 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and bladder cancer risk

2.5 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因頻率和基因型與膀胱癌臨床病理參數之間的關系

在納入的105例膀胱癌患者中，經年齡、性別校正后，Logistic回歸分析結果顯示，LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因頻率和基因型分布與膀胱癌臨床分期、病理分級以及膀胱癌轉移與否均無明顯相關性（均P＞0.05，表3）。

表3 LASS2-3'-UTR的rs8444多態性與膀胱癌臨床病理參數的相關性Table 3 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and clinicopathological characteristics of bladder cancer

表3 LASS2-3'-UTR的rs8444多態性與膀胱癌臨床病理參數的相關性（續表3）Table 3 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and clinicopathological characteristics of bladder cancer

3 討論

膀胱癌的發生發展是一個有多因素參與、多步驟的復雜過程，與遺傳、環境等因素密切相關，其分子機制目前尚不完全清楚。截至目前，已確認多個與膀胱癌易感性相關的SNPs，如染色體3q28區域rs710521位點［7］以及前列腺干細胞抗原基因（prostate stem cell antigen，PSCA）的rs2294008和rs2978974位點［8］。此外，與膀胱癌易感性相關的SNPs也存在著種族和地域差異，如TP53基因密碼子72（TP53 Arg72Pro）多態性增加了南亞克什米爾人群的膀胱癌易感性［9］，但與北歐人群膀胱癌的發病風險無關［10］。

LASS2基因是一個新發現的腫瘤抑制基因，與膀胱癌［5］、前列腺癌［11］、乳腺癌［12］等多種腫瘤的發生發展密切相關。目前針對LASS2基因多態性的研究較少，除Amos等［6］研究發現LASS2基因1q21.3上的SNPs位點rs7412746是皮膚黑色素瘤的易感基因外，國內外鮮見LASS2基因多態性與腫瘤相關性研究的報道。本研究通過對膀胱癌組與對照組患者的膀胱組織樣本進行LASS2-3'-UTR測序，并與Gene Bank檢索的LASS2-3'-UTR序列進行比對后僅發現rs8444 T/C這一SNPs位點。進一步分析發現，膀胱癌組和對照組LASS2-3'-UTR的rs8444位點T/C等位基因頻率及基因型分布差異具有統計學意義，膀胱癌組中攜帶C等位基因或CC基因型的比例均顯著低于對照組（59.52%vs.74.50%，χ2=10.634，P=0.001；35.24%vs.55%，χ2=10.267，P=0.006）；與攜帶T等位基因或TT基因型相比，攜帶C等位基因或CC基因型的個體可分別降低0.489倍或0.258倍的膀胱癌發病風險（OR=0.489，95%CI為0.309～0.772，P=0.002；OR= 0.258，95%CI為0.081～0.827，P=0.023）。此外，本研究對LASS2-3'-UTR的rs8444位點T/C等位基因頻率及基因型與膀胱癌臨床病理參數的相關性也進行了分析，結果發現LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因頻率和基因型分布在不同的臨床分期、病理分級和有否轉移的膀胱癌患者間無顯著性差異（均P＞0.05）。以上結果初步提示LASS2-3'-UTR的rs8444位點C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的發病風險，但與膀胱癌臨床分期、病理分級和有否轉移等無明顯相關性。

眾所周知，基因通過3'-非翻譯區與其上游的miRNA靶向結合，基因mRNA降解或翻譯抑制依賴于其上游miRNA表達量，以及基因mRNA轉錄本和miRNA之間的互補程度［13］。即使靶基因3'-非翻譯區只發生了單個核苷酸的改變，都有可能破壞原有的或產生新的miRNA靶基因結合位點，影響腫瘤相關基因的表達［14］，進而影響腫瘤的發生發展［15］。因此本研究推測，LASS2-3'-UTR的rs8444位點C等位基因和CC基因型通過改變上游miRNA與LASS2基因的結合能力甚至是結合位點，增加LASS2轉錄后水平的活性，使LASS2基因表達增加，從而降低膀胱癌發生的風險；LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多態性與膀胱癌進展無明顯相關性，可能是由于膀胱癌發生發展的機制復雜多變，單一基因多態性并不能完全解釋腫瘤的進展。此外本項研究尚有一定局限性：1）本研究是以醫院為基礎的病例對照研究，固有的選擇偏差不能完全排除；2）本研究非大樣本數據研究，樣本量的適中削弱了分層分析的統計學強度；3）云南雖然是個多民族地區，但本組資料仍以漢族為主，其他少數民族病例數過少，限制了對民族因素的進一步分析。

綜上所述，LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多態性與膀胱癌易感性密切相關，但與腫瘤進展無關；C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的發病風險，可能是膀胱癌的一個新的保護因素。下一步將對LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多態性影響膀胱癌易感性的可能機制進行深入研究，并進一步擴大樣本量，探討與少數民族交互的關系。

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359-386.

[3]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015 [J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[4]Xu XY,Pei F,You JF.TMSG-1 and its roles in tumor biology[J].Chin J Cancer,2010,29(7):697-702.

[5]Zhao Q,Wang H,Yang M,et al.Expression of a tumor-associated gene,LASS2,in the human bladder carcinoma cell lines BIU-87, T24,EJ and EJ-M3[J].Exp Ther Med,2013,5(3):942-946.

[6]Amos CI,Wang LE,Lee JE,et al.Genome-wide association study identifies novel loci predisposing to cutaneous melanoma[J].Hum Mol Genet,2011,20(24):5012-5023.

[7]Stern MC,Van Den Berg D,Yuan JM,et al.Sequence variant on 3q28 and urinary bladder cancer risk:findings from the Los Angeles-Shanghai bladder case-control study[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(11):3057-3061.

[8]Fu YP,Kohaar I,Rothman N,et al.Common genetic variants in the PSCA gene influence gene expression and bladder cancer risk[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(13):4974-4979.

[9]Pandith AA,Shah ZA,Khan NP,et al.Role of TP53 Arg72Pro polymorphism in urinary bladder cancer predisposition and predictive impact of proline related genotype in advanced tumors in an ethnic Kashmiri population[J].Cancer Genet Cytogenet,2010,203(2): 263-268.

[10]Pineda S,Milne RL,Calle ML,et al.Genetic variation in the TP53 pathway and bladder cancer risk.a comprehensive analysis[J]. PLoS One,2014,9(5):e89952.

[11]Yu W,Wang L,Wang Y,et al.A novel tumor metastasis suppressor gene LASS2/TMSG1 interacts with vacuolar ATPase through its homeodomain[J].J Cell Biochem,2013,114(3):570-583.

[12]Fan S,Niu Y,Tan N,et al.LASS2 enhances chemosensitivity of breast cancer by counteracting acidic tumor microenvironment through inhibiting activity of V-ATPase proton pump[J].Oncogene, 2013,32(13):1682-1690.

[13]Ambros V.The functions of animal microRNAs[J].Nature,2004,431 (7006):350-355.

[14]Preskill C,Weidhaas JB.SNPs in microRNA binding sites as prognostic and predictive cancer biomarkers[J].Crit Rev Oncog,2013,18 (4):327-340.

[15]Shaw G.Polymorphism and single nucleotide polymorphisms(SNPs) [J].BJU Int,2013,112(5):664-665.

（2016-10-27收稿）

（2017-01-16修回）

Analysis of the correlation between rs8444 polymorphisms located within LASS2-3′-UTR and susceptibility of bladder cancer

Yujin CHEN1,2,Haifeng WANG1,Ruping YAN1,Changxing KE1,Mingxia DING1,Ting LUAN1,Renchao ZOU1,Jiansong WANG1
Correspondence to:Jiansong WANG;E-mail:jiansongwang@126.com

1Department of Urology,The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Yunnan Institute of Urology,Kunming 650101, China;2Department of Nephrology,New District Hospital of People's Hospital of Chuxiong Yi Autonomous Prefecture,Chuxiong 675000,China

This work was supported by the Project of Yunnan Provincial Science and Technology(No.2015FB196)and the Yunnan Provincial Department of Education Fund(No.2014Z072)

Objective:To explore the correlation between single nucleotide polymorphisms(SNPs)in Homo sapiens longevity assurance homologue 2(LASS2)gene 3′‐untranslated regions(UTR)and susceptibility of bladder cancer among residents of Yunnan,China.Methods:A total of 105 bladder cancer patients(bladder cancer group)and 100 nonbladder cancer patients(control group)were selected.PCR method and sequence for LASS2-3′‐UTR were performed to identify the SNPs correlated with bladder cancer.The relationships between the LASS2-3′‐UTR polymorphisms and bladder cancer risk were analyzed.Results:An SNP(rs8444)was identified in LASS2-3′‐UTR,and the T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 largely differed between the bladder cancer and control groups(χ2=10.267,P=0.006;χ2=10.634,P=0.001).Individuals that carry the rs8444 C allele or CC genotype had a remarkably lower risk of bladder cancer compared with those that carry the T allele or TT genotype(OR=0.489,95%CI:0.309-0.772,P=0.002;OR= 0.258,95%CI:0.081-0.827,P=0.023).No significant correlations were observed between the T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 and TNM stage,as well as histological grade and distant metastasis in bladder cancer(P＞0.05).Conclusion:The rs8444 C allele or CC genotype located within LASS2-3′‐UTR can lower the susceptibility of bladder cancer among the residents of Yunnan,China.However,it is not associated with the TNM stage,histological grade,and distant metastasis.

Homo sapiens longevity assurance homologue 2,bladder cancer,polymorphism,single nucleotide

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.240

①昆明醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，云南省泌尿外科研究所（昆明市650101）；②云南省楚雄州人民醫院新區腎臟內科

*本文課題受云南省科技計劃（編號：2015FB196）和云南省教育廳科學研究基金項目（編號：2014Z072）資助

王劍松 jiansongwang@126.com

陳玉錦 專業方向為膀胱癌的臨床治療及基礎研究。

E-mail：yncxcyj@sina.com