液滴數字PCR在乳腺癌精準治療中的應用

張博誠 張顯玉 孫根 綜述 龐達 審校

·綜 述·

液滴數字PCR在乳腺癌精準治療中的應用

張博誠①張顯玉①孫根②綜述 龐達①審校

在精準醫學大背景下，分子分型指導下的乳腺癌個體化治療雖已成為常態，但仍需不斷尋求更加優質高效的精準治療方案。液滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）在稀有基因突變檢測、拷貝數變異檢測以及與下一代測序技術相整合等方面，較傳統的實時熒光定量PCR表現出明顯的優勢。本文針對ddPCR平臺在不同乳腺癌亞型中的應用，以及對ddPCR技術助力下的乳腺癌的研究進行綜述。

液滴數字PCR 乳腺癌 精準治療 基因突變 基因檢測

精準醫學是指根據個體的分子變異指導疾病的預防和治療。腫瘤的精準醫學研究是整合臨床信息和分子生物學技術，鑒定與腫瘤生物學行為和治療應答密切相關的分子標志物，并在設計合理的臨床試驗中用于驗證，指導腫瘤的精準分型和治療。乳腺癌是一種高度異質性的腫瘤，由分子分型指導的治療近年來已取得初步成效，但乳腺癌的耐藥和異質性問題目前仍是其基礎和臨床研究面臨的巨大挑戰。第二代實時熒光定量PCR（qPCR）最大的技術瓶頸依然是依賴Ct值、PCR擴增效率以及標準曲線，所謂的“定量”也只是相對、間接的，而且在目標核酸分子豐度低、樣本間模板濃度差異細微的情況下，qPCR的檢測靈敏度、精確度都受到了限制，已不能滿足生命科學研究應用發展的需求。在這樣的背景下，液滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術應運而生。本文就對不同乳腺癌亞型中ddPCR的應用進行綜述。

1 ddPCR原理及優勢

ddPCR是一種檢測核酸分子的絕對定量技術，ddPCR微滴發生器可將含有核酸分子的熒光PCR反應體系“分割”成數萬個納升級的微滴，核酸分子在各微滴中隨機分裝，每個微滴或不含、或含有至少一個目標核酸分子，每個微滴都是一個獨立的PCR反應器（圖1）。經PCR擴增后，微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為“1”，無熒光信號的微滴判讀為“0”，從而將熒光模擬信號數字化；最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，通過分析軟件可直接給出目標核酸分子的拷貝數濃度，因此不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，所以ddPCR受擴增效率的影響大幅度降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大幅度提高［1］。

ddPCR微滴化的過程可降低與具有競爭性作用的目標序列的濃度，實現稀有序列的富集以及痕量核酸檢測。由于ddPCR采取終點判讀的方法，在引物設計過程中可減少因擴增效率不合要求而造成的浪費（時間、樣品、耗材等）。拷貝數變異（copy num?ber various，CNVs）研究需要極高的精度以區別不同拷貝數之間的微小差異，ddPCR通過直接計數目標基因與參照基因（已知拷貝數）的數目并計算比值，即可得到目標基因的拷貝數［2］。目前對于檢測血漿游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）技術上可分為下一代測序（next-generation sequencing，NGS）和ddPCR兩種平臺。近年來NGS技術飛速發展，為進一步發揮NGS技術的優勢，ddPCR可有效驗證NGS技術捕獲的基因突變，并且可較好地整合實驗流程（圖2），建立目標測序、個體生物標志物開發、化療后外周血檢測的完整研究路線［3］。

圖1 ddPCR基本原理Figure 1 Basic principles of ddPCR

圖2 ddPCR與NGS技術相互整合Figure 2 Integration of ddPCR and NGS technology

2 ddPCR在不同乳腺癌亞型中的應用

2.1 激素受體陽性乳腺癌

目前，約2/3的浸潤性乳腺癌為Luminal A或B型，即激素受體（hormone receptor，HR）陽性乳腺癌，ddPCR在這兩型乳腺癌中的研究主要是圍繞內分泌治療（endocrine therapy，ET）的耐藥問題，缺乏獨立分型研究，故本文以HR陽性乳腺癌進行論述。在HR陽性轉移性乳腺癌中，雖然ET為一線治療［4］，但是在反復的ET中腫瘤均產生了對雌激素的抵抗力，變成非激素依賴型。近年來，雌激素受體1（estrogen re?ceptor 1，ESR1）激活突變是研究的熱點。通過NGS技術，發現ESR1突變的富集區在537號酪氨酸和538號天冬氨酸，即ESR1 Y537S、Y537N、Y537C、D538G，涵蓋80%以上ESR1突變，并與ET抵抗相關［5-7］。為將這些發現的突變位點作為一種ET抵抗的生物標志物，應在疾病進展時同步進行ESR1基因型分析，cfD?NA分析就是為克服組織活檢不便而建立的方法。為了在極少量的cfDNA中獲取ESR1突變頻率并證明其臨床作用價值，在10%～30%ET耐藥的HR陽性轉移性乳腺癌中，應用NGS技術確認ESR1-LBD基因出現突變富集［5-6］，在原發性乳腺腫瘤（primary breast tumor，PBT）中普遍認為ESR1突變頻率非常低（＜1%）或檢測不到。Wang等［8］采用ddPCR技術，在43例PBT中發現ESR1 Y537S、Y537C、D538G也存在7%（3/43）的等位基因突變。同樣，Takeshita等［9］在270例PBT中發現ESR1突變頻率為2.6%（7/270）。這兩項研究結果表明，ESR1突變頻率在PBT中或NGS技術檢測的閾值之下，也充分證明了ddPCR進行痕量檢測的優勢，以及選擇不同的cut-off值可能會帶來不同的分析結果。另外，Wang等［8］對4例患者cfDNA中ESR1突變頻率進行了持續的監測，發現在治療的過程中ESR1等位基因突變頻率發生改變，揭示了ddPCR監測腫瘤負荷的潛能，可及時調整ET方案。

目前，在輔助治療階段因缺乏系統的基因組跟蹤隨訪，輔助治療中或治療后HR陽性乳腺癌患者擔心復發。Gu等［10］提出這樣一種治療方式，即在基線期采集HR陽性乳腺癌患者的腫瘤組織及血液樣本，應用NGS技術檢測相關腫瘤基因突變；新輔助治療后，應用ddPCR檢測相應的腫瘤組織和血液樣本，同時與相匹配的基線期樣本進行基因突變頻率比較；術后則通過cfDNA進行基因突變狀態監測。ESR1突變可采用ddPCR評估，其他新出現的驅動基因突變或亞克隆衍變可采用NGS技術捕獲。若ESR1等位基因突變頻率增加，ET方案則相應調整，這種治療方式或更符合精準醫療的理念。

2.2 HER-2陽性乳腺癌

人表皮生長因子-2（human epidermal growth fac?tor receptor-2，HER-2），又稱c-erbB-2基因，定位于染色體17q12-21.32上，HER-2過表達可激活表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）的信號通路并促進EGFR介導的轉化和腫瘤的發生。隨著靶向治療在臨床中的成功應用，HER-2狀態的精準檢測顯得尤為重要。目前，免疫組織化學（IHC）與熒光原位雜交（FISH）法作為HER-2過表達診斷的金標準，仍在臨床檢測中存在一些技術問題。IHC的結果判定易受檢驗者主觀因素的影響，而FISH存在操作繁瑣耗時、價格昂貴、參比位點17號染色體著絲粒（CEP17）狀態并不等同于17號染色體的狀態等問題，另外由于方法學本身的局限性，IHC和FISH的檢測結果均有不確定性。因此，需要更精準、客觀、高效的HER-2檢測平臺。ddPCR對石蠟包埋組織（for?malin-fixed and paraffin-embedded tissues，FFPET）進行HER-2基因轉錄水平［11］及CNVs［12］精準檢測的臨床應用潛力已得到證實。Belgrader等［12］應用ddPCR對39例DNA已高度降解的FFPET進行HER-2檢測，結果顯示10例樣本中HER-2陽性，29例樣本中HER-2陰性，這與FISH及IHC結果完全一致。

ddPCR同樣適用于在cfDNA中檢測HER-2的CNVs。Gevensleben等［13］選擇1.25作為cut-off值，結果顯示在11例FISH及IHC確認的HER-2陽性樣本中，ddPCR檢出的HER-2陽性率為64%（7/11），在47例FISH及IHC確認的HER-2陰性樣本中，ddPCR檢出的HER-2陰性率為94%（44/47）。其中FISH及IHC檢測的組織均源于PBT，3個假陽性結果的分析顯示可能是因參照基因少量的丟失，或這些患者腫瘤發生轉移后真的獲得了HER-2的擴增；3個假陰性結果的分析表明這種不一致性可能反映了基因組HER-2狀態的改變，因所有假陰性結果的患者在腫瘤發生轉移后均接受過抗HER-2治療，可能導致腫瘤內部異質性的選擇而變成非HER-2擴增型。Gar?cia-Murillas等［14］選擇2.0為cut-off值，結果顯示在18例FISH及IHC確認的HER-2陽性樣本中，ddPCR檢出的HER-2陽性率為100%（18/18），在58例FISH及IHC確認的HER-2陰性樣本中，ddPCR檢出的HER-2陰性率為98%（57/58），敏感性和特異性分別為100%和98%。應用ddPCR對HER-2的CNVs開展精準檢測，理論依據充分，為下一步臨床應用奠定了基礎。

近期一項關于胃癌的HER-2研究中［15］，采用ddPCR對cfDNA中HER-2狀態進行持續監測，揭示術前、術后或復發時HER-2狀態的變化。提示曲妥珠單抗的治療或具有時間和空間異質性，在治療的過程中或因遺傳分化伴隨著腫瘤衍變，亦或化療引起腫瘤內部異質性的選擇，造成HER-2狀態的改變，從而影響臨床治療決策。應用ddPCR對乳腺癌圍手術期、化療或轉移前后HER-2狀態進行持續監測值得借鑒。

2.3 三陰性乳腺癌

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TN?BC）是一種雌激素受體、孕激素受體和HER-2均不表達的乳腺癌亞型，因此不能從現有的ET及靶向治療中獲益。現階段，化療是TNBC的標準治療，但其復發率及病死率仍較高［16］。TNBC是一種高度異質性的腫瘤，目前分子病理和基因表達譜是識別TNBC亞型、尋找新的治療靶點以及發現體細胞基因突變的公認方式［17］。

PIK3CA是近年來致癌基因的研究熱點，編碼磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinases，PI3Ks）信號通路中的p110復合物。在乳腺癌中PIK3CA突變占20%～40%［18］，是繼TP53基因之后第二常見的突變基因。一項Meta分析表明，PIK3CA突變的臨床意義依據不同的乳腺癌表面受體類型而不同［19］。臨床上已證實，PIK3CA突變本身對于HR陽性乳腺癌患者預后價值有限［20］，但在TNBC中關于PIK3CA突變的臨床意義鮮有報道。

現已證實在TNBC中雄激素受體（AR）與PI3Ks信號通路相關，包括PIK3CA突變［21］，但AR表達與TNBC預后關系尚存爭議。因此，在TNBC中檢測PIK3CA突變對其預后以及對AR信號通路的影響具有重要意義。Takeshita等［22］應用ddPCR首先對49例血液樣本及42例相對應的腫瘤組織樣本中PIK3CA突變頻率進行分析，結果顯示二者之間并不相關，但這并不有損ddPCR的準確性。原因為：1）每個樣本中的PIK3CA突變陽性及陰性已均由ddPCR系統Bio?Mark［23］證實；2）研究結果反映日益凸顯的腫瘤異質性問題，ESR1突變頻率在cfDNA中與腫瘤組織中的檢測結果不同，可能是由腫瘤異質性所引起［24］；3）采取Cox多元風險模型分析患者的生存情況，結果顯示在cfDNA中PIK3CA突變組較野生組可顯著延長無復發生存時間［22］。在cfDNA中PIK3CA有望作為一種腫瘤標記物，用于評估TNBC輔助治療的療效。

3 結語

乳腺癌是高度異質性的腫瘤，隨著分子生物學技術的發展，更多的乳腺癌易感基因及驅動基因逐漸被發現。ddPCR技術帶來了全新的技術思路和研究手段，相比qPCR具有更出色的靈敏度、特異性和精確性，并且可與NGS技術相互補充整合。目前，已普遍認可ddPCR技術在痕量核酸檢測、稀有基因突變檢測及CNVs研究方面的技術優勢。通過ddPCR平臺，持續監測HR陽性乳腺癌患者的ET耐藥的驅動基因，精準檢測HER-2陽性乳腺癌患者中的CNVs，及與NGS技術協同發現并確認TNBC治療的新靶點等方面都具有重要意義，并有助于進行更高層次的乳腺癌分子生物學研究。

[1]Whale AS,Huggett JF,Cowen S,et al.Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation[J].Nucleic Acids Res,2012,40(11):e82.

[2]Marx V.PCR:paths to sensitivity[J].Nat Methods,2014,11(3):241-245.

[3]Day E,Dear PH,McCaughan F.Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine[J].Methods,2013,59(1):101-107.

[4]Rugo HS,Rumble RB,Macrae E,et al.Endocrine therapy for hormone receptor-positive metastatic breast cancer:American Society of Clinical Oncology Guideline[J].J Clin Oncol,2016,34(25): 3069-3103.

[5]Robinson DR,Wu YM,Vats P,et al.Activating ESR1 mutations in hormone-resistant metastatic breast cancer[J].Nat Genet,2013,45 (12):1446-1451.

[6]Toy W,Shen Y,Won H,et al.ESR1 ligand-binding domain mutations in hormone-resistant breast cancer[J].Nat Genet,2013,45(12):1439-1445.

[7]Jeselsohn R,Yelensky R,Buchwalter G,et al.Emergence of constitutively active estrogen receptor-αmutations in pretreated advanced estrogen receptor-positive breast cancer[J].Clin Cancer Res,2014,20 (7):1757-1767.

[8]Wang P,Bahreini A,Gyanchandani R,et al.Sensitive detection of mono-and polyclonal ESR1 mutations in primary tumors,metastatic lesions and cell free DNA of breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2016,22(5):1130-1137.

[9]Takeshita T,Yamamoto Y,Yamamoto-ibusuki M,et al.Droplet digital polymerase chain reaction assay for screening of ESR1 mutations in 325 breast cancer specimens[J].Transl Res,2015,166(6): 540-553.

[10]Gu G,Fuqua SA.ESR1 mutations in breast cancer:proof-of-concept challenges clinical action[J].Clin Cancer Res,2016,22(5):1034-1036. [11]Heredia NJ,Belgrader P,Wang S,et al.Droplet digital?PCR quantitation of HER-2 expression in FFPE breast cancer samples[J].Methods,2013,59(1):S20-23.

[12]Belgrader P,Tanner SC,Regan JF,et al.Droplet digital PCR measurement of HER-2 copy number alteration in formalin-fixed paraffinembedded breast carcinoma tissue[J].Clin Chem,2013,59(6):991-994.

[13]Gevensleben H,Garcia-Murillas I,Graeser MK,et al.Noninvasive detection of HER-2 amplification with plasma DNA digital PCR[J].Clin Cancer Res,2013,19(12):3276-3284.

[14]Garcia-Murillas I,Lambros M,Turner NC.Determination of HER-2 amplification status on tumour DNA by digital PCR[J].PLos One,2013, 8(12):e83409.

[15]Shoda K,Ichikawa D,Fujita Y,et al.Monitoring the HER-2 copy number status in circulating tumor DNA by droplet digital PCR in patients with gastric cancer[J].Gastric Cancer,2017,20(1):126-135.

[16]Abramson VG,Mayer IA.Molecular heterogeneity of triple negative breast cancer[J].Curr Breast Cancer Rep,2014,6(3):154-158.

[17]Shah SP,Roth A,Goya R,et al.The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers[J].Nature,2012, 486(7403):395-399.

[18]Stemke-Hale K,Gonzalez-Angulo AM,Lluch A,et al.An integrative genomic and proteomic analysis of PIK3CA,PTEN,and AKT mutations in breast cancer[J].Cancer Res,2008,68(15):6084-6091.

[19]Cizkova M,Susini A,Vacher S,et al.PIK3CA mutation impact on survival in breast cancer patients and in ERα,PR and ERBB2-based subgroups[J].Breast Cancer Res,2012,14(1):R28.

[20]Pang B,Cheng S,Sun SP,et al.Prognostic role of PIK3CA mutations and their association with hormone receptor expression in breast cancer:a meta-analysis[J].Sci Rep,2014,4:6255.

[21]Lehmann BD,Bauer JA,Schafer JM,et al.PIK3CA mutations in androgen receptor-positive triple negative breast cancer confer sensitivity to the combination of PI3K and androgen receptor inhibitors [J].Breast Cancer Res,2014,16(4):406.

[22]Takeshita T,Yamamoto Y,Yamamoto-Ibusuki M,et al.Prognostic role of PIK3CA mutations of cell-free DNA in early-stage triple negative breast cancer[J].Cancer Sci,2015,106(11):1582-1589.

[23]Sueta A,Yamamoto Y,Yamamoto-Ibusuki M,et al.An integrative analysis of PIK3CA mutation,PTEN,and INPP4B expression in terms of trastuzumab efficacy in HER-2-positive breast cancer[J].PLos One, 2014,9(12):e116054.

[24]Chu D,Paoletti C,Gersch C,et al.ESR1 mutations in circulating plasma tumor DNA from metastatic breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2016,22(4):993-999.

（2016-11-10收稿）

（2017-01-19修回）

Application of droplet digital PCR in the precision treatment of breast cancer

Bocheng ZHANG,Xianyu ZHANG,Gen SUN,Da PANG

Da PANG;E-mail:pangdasir@163.com

In the context of precision medicine,although individual treatment of breast cancer under the guidance of molecular classification has become the norm,a precision treatment program with increased efficiency and quality is still required.Compared with the traditional real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(PCR),the droplet digital PCR(ddPCR)has obvious advantages in the detection of rare mutations and copy number variations,as well as the integration with the second-generation-sequencing technology.This paper reviews the application of a ddPCR platform in different breast cancer subtypes and explores new horizons of breast cancer research through the ddPCR technology.

droplet digital PCR,breast cancer,precision treatment,gene mutation,gene detection

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.300

①哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科（哈爾濱市150081）；②肇東市人民醫院外科

龐達 pangdasir@163.com

Department of Breast Cancer Surgery,Harbin Medical University Cancer Hospital,Harbin 150081,China

張博誠 專業方向為乳腺腫瘤相關臨床及基礎研究。

E-mail：hmubocheng@163.com