微球體培養富集腫瘤干細胞及其潛在的臨床應用*

付欣 王珂

·國家基金研究進展綜述·

微球體培養富集腫瘤干細胞及其潛在的臨床應用*

付欣 王珂

腫瘤干細胞假說是近年來提出的關于腫瘤的新理論，該理論認為腫瘤干細胞在腫瘤發生、發展和轉移等過程中起著決定性的作用，腫瘤干細胞理論的提出給腫瘤治療提供了新的思路和策略。但是，腫瘤中只有一小部分細胞為腫瘤干細胞，因此鑒定并富集這些細胞以進一步研究是眾多科研人員面臨的巨大挑戰。微球體培養技術是近年發展起來的一種有效富集腫瘤干細胞的技術，該技術的應用使腫瘤干細胞的研究變得更加容易，并使臨床應用這些細胞來評價腫瘤進展及患者預后成為可能，本文將對該技術及其與微系統的整合進行詳細的闡述。

腫瘤干細胞 微球體培養 生物標記 微系統

腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）假說認為在異質性的腫瘤中只有一小部分細胞具有干細胞的特性，可促進腫瘤生長，并對放化療有著更強的耐受性［1］。傳統的腫瘤治療方法只清除了大多數的癌細胞，但是CSC仍然存在，而這一小部分細胞正是腫瘤轉移和復發的潛能細胞［2］，所以更好地理解CSC的分子及細胞生理學，并發展可用于臨床的CSC病理診斷方法將是幫助患者消除腫瘤的關鍵。然而，目前的活檢技術只是分析大多數細胞群的分子標志，但少數的CSC則不能被檢出，因此如何富集這些細胞來做進一步的研究將是眾多科研人員面臨的巨大挑戰。隨著科研人員對腫瘤干細胞的研究，微球體培養技術應運而生，該技術是近年發展起來的一種有效富集腫瘤干細胞的技術。目前科研人員應用微球體培養技術已經在淋巴瘤、乳腺癌、結直腸癌、鼻咽癌、口腔鱗癌等多種腫瘤中成功分離出CSC［3-6］，說明無論是貼壁生長的細胞還是懸浮培養的細胞均可以利用該技術分離CSC。但是通過查閱大量文獻發現，每個實驗室對于微球體培養技術的理解和應用該技術分離干細胞的具體操作方法不盡相同，而且不同癌種分離干細胞所需要的器皿類型和培養基種類也略有差異［6-7］。更好地理解并利用該技術，對CSC的研究和腫瘤的治療有重要意義。本文將就微球體培養技術及其應用，以及與微系統的整合進行詳細介紹。

1 微球體培養技術

1.1 富集CSC的常用方法

目前富集CSC常用的方法有熒光激活細胞分離技術（fluorescence activated cell sorting，FACS）、側群干細胞檢測技術、特異蛋白標志物分選技術以及微球體培養技術。FACS的工作原理是將細胞與特異的熒光標記抗體孵育，利用FACS系統將被標記的細胞分選出來。從原理上來說，FACS分選CSC對于腫瘤的診斷和預后是一個較好的選擇，但FACS對于樣品的制備非常繁瑣并且需要有經驗的工作人員操作，而且FACS需要大量的細胞，因此會損失很多樣品；另外由于CSC表型并非一成不變，所以FACS的推廣實施存在很多技術難題［8］。側群干細胞檢測技術的工作原理是利用CSC強大的細胞膜泵功能，將細胞進行Hoechst 33342或羅丹明123染色，由于CSC能夠將染料排出，從而根據細胞內是否有熒光染料將細胞進行分選，但是該技術對設備和技術要求較高，一般實驗室難以實施，另外染料本身具有一定的細胞毒性，而且樣本制備過程較為復雜，導致干細胞活性降低［9］。另外，細胞還可以通過CSC表面的特異蛋白標志來分選［10-12］，但是該方法同樣面臨標志蛋白特異性的問題。所以以上方法的實施均受到各方面的限制，因此需要一個更有效的富集CSC的技術。

1.2 微球體培養技術原理及優缺點

早期研究腫瘤干細胞的實驗為探索富集CSC的新方法提供了一定的線索，在低黏附板中利用含EGF的無血清培養液培養神經細胞，結果選擇性地形成了懸浮的多潛能克隆球，這些克隆球被稱為神經球。隨后研究人員從腦腫瘤樣本中獲得的細胞，利用相似的培養條件培養后也獲得了神經球，證明該技術可以用于富集CSC［13］。微球體培養技術是根據腫瘤干細胞與普通腫瘤細胞的生長特性不同發展而來的，普通腫瘤細胞對培養基中的血清及貼壁培養要求較高，而腫瘤干細胞對生長因子依賴性強，將細胞懸浮培養在含有生長因子的無血清的培養基中，其中只有具有自我更新能力的干細胞可以增殖并形成致密的細胞球，而非干細胞因不具備自我更新能力而逐漸死亡。目前，微球體培養干細胞技術已經成為研究CSC的一種普遍方法。由于微球體培養技術是通過細胞間不同生長特性而分選培養的，無需對細胞進行染色標記等處理，因此對細胞的活性幾乎無影響，并且對設備的要求較低。但微球體培養技術與常規的腫瘤細胞培養不同，每個實驗室對于微球體培養技術的理解和應用該技術分離干細胞的具體操作方法不盡相同，而且不同癌種分離干細胞所需要的器皿類型和培養基種類也略有差異，因此單一的培養條件并不適用于所有的腫瘤干細胞克隆球的分選與培養，對不同的腫瘤干細胞需要逐個進行培養條件的探究。

1.3 微球體培養技術的操作要點

由于血清可以促進細胞分化，所以微球體培養利用無血清的干性培養基，同時要保證細胞生長，故在干性培養基中添加細胞生長因子。常用的干性培養基有神經基礎培養基和DMEM/F12等，生長因子有表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和血小板衍化生長因子等，有些干細胞培養還要添加B27、胰島素等，細胞不同所添加的試劑不同，所以需要對每種干細胞的最佳培養條件進行摸索。統計部分腫瘤干細胞成球培養所需的生長因子及濃度，EGF和b-FGF是必須的，但其濃度在不同的腫瘤干細胞培養中也不盡相同（表1）。另外，有些腫瘤具有自分泌細胞生長因子的功能，所以在不添加生長因子的干性培養基中依然可以成球［14］。細胞貼壁可以促進細胞分化，所以干細胞成球培養需要非黏附培養皿，超低密度培養可以保證CSC球來源于一個單克隆細胞，通常鋪種細胞的密度＜1×10/μL［20］。

1.4 微球體的傳代與凍存

干細胞傳代理論上與普通細胞傳代一樣，可以無限傳代，并保持干細胞特性。但有研究發現，長期懸浮培養的乳腺干細胞隨著代數增加，細胞球逐漸減少、形成比率減小，分化為肌上皮的細胞數逐漸增多，而且細胞出現衰老現象［21］，提示隨著傳代干細胞特性逐漸缺失。CSC在培養過程中保持干性傳代的數目尚無定論，不同種類的干細胞可能保持干性的代數不同，這就需要在傳代過程中注意細胞的分化，必要時檢測細胞干性標志物，而且在實驗過程中盡量減少傳代次數。另外，有研究發現不同的消化干細胞球的方法對維持細胞的干性有著顯著的影響，程春鳳等［22］比較了四種消化方法對神經干細胞干性的影響，發現單純的0.02%EDTA可以較好的維持細胞干性，且對細胞的后續損傷相對較小。

表1 不同的腫瘤干細胞相對應的生長因子和濃度Table 1 The corresponding growth factor and concentration of different tumor stem cells

目前對于干細胞如何更好地凍存，不同的實驗室采用不同的方法［23-25］，以微球體的形式凍存還是以單細胞懸液的形式凍存也尚無定論。Mao等［26］將微球體消化呈單細胞懸液進行凍存，檢測了細胞凍存前后細胞的活性、增殖能力、成球能力、成瘤能力，發現單細胞懸液凍存可以很好的維持干細胞特性。另有研究認為干細胞若以球體形式凍存，凍存液中的營養成分難以到達球體中心，從而影響細胞的活性，所以認為干細胞凍存以單細胞形式較好［27］。此外，各實驗室配制凍存液的成分也不盡相同，由于血清可以促進干細胞分化，所以為避免細胞分化在凍存液中不需要添加血清。另外，關于凍存液中DMSO比例問題，有研究表明10%的DMSO凍存干細胞能更好的保持細胞干性，而且復蘇的細胞存活更好［23，28］。

2 微球體培養技術的應用

2.1 微球體培養技術鑒定并富集CSC

動物體內原位移植法是鑒定CSC的主要方法，具體操作方法是首先利用表面標志物分選細胞亞群，再將這些亞群按不同細胞梯度接種到免疫缺陷小鼠體內，再比較這些亞群的成瘤能力，從而篩選出干細胞的優勢標志物，但是這種方法耗時較長。而微球體培養技術相對簡單，耗時短。利用微球體培養技術，已經成功分離了多種干細胞，如神經干細胞、膠質瘤的干細胞、結直腸癌的干細胞等等［1，5，16］。Dontu等［29］首次證明了無血清非黏附的培養條件可富集人乳腺上皮細胞中的乳腺干細胞。既然通過微球體培養技術可富集乳腺組織中的干細胞，該技術發現后證實乳腺癌細胞也可以形成微球體。Ponti等［30］利用該技術在乳腺腫瘤組織及MCF-7細胞系中均培養出乳腺微球體。從乳腺微球體中獲得的細胞具有與干細胞相同的蛋白表達模式，并且注射1 000個MCF-7微球體細胞于小鼠乳腺脂肪墊，就可以起始腫瘤形成，而普通的MCF-7細胞起始腫瘤則需要100萬個。后期Shaw等［31］的研究也得到相似的結果。隨后在黑色素瘤、前列腺癌及膠質瘤利用微球體均富集了CS。

2.2 微球體培養技術可發現生物標記并協助治療

目前，許多實驗室應用微球體技術鑒定出了CSC的特異生物標記，并以此為臨床腫瘤患者提供一個更全面的診斷。Ponti等［30］利用人乳腺癌組織進行微球體培養，發現形成微球體的細胞上皮細胞分子標記低表達，而這些細胞分化后上皮標記蛋白表達水平又恢復，該研究同時證實乳腺癌CSC表型是CD44+/ CD24-。另外一個關于CSC生物標記的重要研究顯示，形成微球體的乳腺癌細胞呈ALDH陽性，而AL? DH陰性的細胞均不能形成微球體［32］。因此，ALDH也可以作為CSCs的一個標記。同樣，利用低黏附培養條件下的微球體形成技術，Tirino等［33］發現CD133是非小細胞肺癌CSCs的一個重要生物標記。

許多科研小組利用微球體技術來研究維持CSC表型相關的信號通路，這些通路可以作為CSCs的標志以及潛在的藥物靶點。Hedgehog信號通路在維持干細胞的自我更新和增殖中具有重要作用。有研究發現細胞因子IL-8可增強乳腺癌細胞系的成球能力，因此證實IL-8與維持CSC表型相關［34］。Fillmore等［35］發現雌激素刺激可以增強MCF-7的微球體形成能力，進一步研究證實雌激素通過FGF/FGFR/Tbx3信號通路增加了CSCs的數目。Msi1（Musashi1）是Notch和Wnt通路中一個重要調節因子，研究發現Msi1與乳腺癌細胞系的微球體形成能力相關，Msi1敲除后微球體形成能力減弱，所以認為Msi1是CSCs的一個標識，這也許可以成為一個新的藥物靶點。另外，有研究利用微球體培養技術發現異位表達Oct4和Nanog增強了肺癌細胞系的成球能力、耐藥性以及發生EMT的趨勢［36-37］。

微球體分析同樣應用于對CSCs有效的藥物篩選。微球體技術證實許多常用的化療藥物，包括阿霉素、紫杉醇等，均對CSCs無效［38］。該研究通過對多種化學藥物篩選發現鹽霉素可能是對CSCs有效的藥物，因為與紫杉醇相比，鹽霉素明顯減弱了乳腺癌細胞形成微球體的能力。Bandyopadhyay等［39］利用微球體技術證實阿霉素對CSCs無效，但是阿霉素聯合TGF-β1抑制劑對CSCs有效。另一項關于潛在藥物的研究發現，蘿卜硫素可以抑制乳腺癌細胞系的微球體形成［40］，利喘貝能夠減弱MDA-MB-231的微球體形成［41］?？傊瑢τ谛盘柾飞蠞撛诎悬c的研究以及潛在藥物的篩選鑒定，都證明微球體分析技術是一種非常有用的工具。

2.3 微球體培養技術的潛在臨床應用

微球體培養富集CSC的技術已經在科研領域廣泛應用，由于利用乳腺癌組織及胸膜滲出液中的細胞來進行微球體培養是可行的，因此認為在臨床上可應用該技術從患者的活檢組織中來富集、鑒定及進一步研究CSC。目前，對于患者的治療方法及預后評估大多通過某些生物標記蛋白的組織染色來確定，但是引起腫瘤耐藥、轉移及復發的只是占腫瘤一小部分的CSC，所以對于腫瘤耐藥及轉移的評估，CSC就顯得非常重要［42］。因此，與傳統的評估方法相比，從腫瘤組織中富集CSCs應用于臨床分析將有更大的臨床意義。

目前臨床上有兩個渠道可以獲取CSC，一是從原發腫瘤的活檢組織中獲取CSC，二是從患者血液中獲得具有轉移潛能的CSC［43］。在獲得腫瘤組織樣本后，去除脂肪、血液等組分，將收集的細胞在微球體培養條件下培養，5～7天后細胞中CSCs會形成微球體，而其他分化細胞則死亡。通過對細胞的病理學分析評估患者的預后及治療方案?？梢詫嫵晌⑶蝮w的細胞進行生物標記的檢測，從而提示轉移的可能性及對藥物的敏感程度。另外，可以利用富集的CSC進行藥物篩選，從而直接確定藥物的作用效果。與單獨的病理診斷結果相比，以上這些檢測方法有利于為患者提供更有效的治療方案。

3 微系統使微球體培養技術的臨床應用成為可能

理論上CSC的相關檢測看似具有非常樂觀的應用前景，但目前在臨床上卻并不實用?，F階段在96孔板上培養微球體以及富集CSC需要許多嚴格繁瑣的步驟。因為相對較少的細胞數量以及微球體的非貼壁生長，對于細胞的收集分析非常的困難。因此這種勞動密集型的過程對于臨床應用并不合適。所以將微球體技術融入到整合的微系統中是目前該技術作為診斷工具的關鍵。微系統可以通過無縫隙集成多種功能來增加自動化及處理能力，避免繁瑣的人工操作。像數量較少的懸浮細胞這類比較難處理的樣品，微系統就顯得尤為方便。Sung等［44］發明了模擬組織及腫瘤組成的3D培養系統，以便在更合適的微環境條件下研究腫瘤。Hsiao等［45］利用共培養前列腺癌細胞與內皮及成骨細胞代表轉移腫瘤，從而更好地模擬腫瘤微環境。盡管這些技術大都應用于實驗研究，但是如果細胞培養微系統能夠更容易操作，其臨床應用潛能較大。

在整合的微系統中實現微球體分析可以突破僅在微球體培養板中分析CSC的局限。首先，一個全面的CSC分析包括細胞復蘇、培養、藥篩及分子分析，這些步驟在微球體培養板中無法進行人工操作，而一個整合的微系統可以將這些集中在一個單獨的裝置中，使對少量細胞的處理不需要人工操作。其次，在培養板中清洗懸浮的細胞是很難做到的，而微系統可以將細胞固定在特定的位置從而進行換液清洗。另外，在培養板中培養的懸浮細胞隨意的漂浮并易于聚集，而在微系統中細胞培養表面被微結構化，細胞就像被困在微孔中，因此可以阻止細胞在培養環境中任意的漂動聚集，從而實現了目前微球體培養無法做到的對單細胞的長期觀察。

4 展望

鑒別并分析原發腫瘤及循環中的CSC是評估腫瘤復發及轉移的關鍵，同樣也是為腫瘤患者制定最有效治療方案的關鍵。從異質性細胞群中鑒別分離特異細胞的傳統方法依賴于FACS，然而，該方法并不適合分離數量較少的細胞，同時由于復雜的操作使FACS在CSC方面的分析很難應用于臨床。在腫瘤生物研究領域，微球體技術成為愈來愈受歡迎的一種分離富集CSC的方法，微球體培養介質及低黏附培養板的商業化，使該技術能更好地應用于研究。但是微球體培養及后續的CSC分析需要大量人力參與，并不適合在臨床系統中應用。微系統的利用使微球體技術在臨床利用成為可能，該系統裝配并不昂貴并且易于操作，重要的是其可以整合一些附加的功能，包括樣品準備及分子分析，因此可以代替大量的人力資源。也正是因為自動化，微球體微系統具有能夠在臨床系統中應用的潛能，從而使未來腫瘤的診斷及治療方法更加完善。

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（2016-08-12收稿）（2016-12-07修回）（編輯：周曉穎 校對：張）

Micro-sphere culture gathers cancer stem cell and its potential clinical application

Xin FU,Ke WANG

Correspondence to:Ke WANG;E-mail:kewang_tj@163.com

Department of Gynecological Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81301895)

Cancer stem cell hypothesis has become a new theory.According to this theory,cancer stem cells play a decisive role in carcinogenesis,progression,and metastasis.This theory offered new ideas and strategies for cancer treatment.However,only a small fraction of cells in a tumor were cancer stem cells.Therefore,the identification and enrichment of these cells are significant challenges for numerous researchers conducting further study.Micro-sphere culture has been an effective tumor stem cell enrichment technology in recent years.The application of this technique makes the cancer stem cell research process easy.In addition,it makes the evaluation of tumor progression and prognosis of patients in clinical possible.This article will focus on the applications of this technology, and microsystem integration will be described in detail.

cancer stem cell,micro-sphere culture,biomarker,microsystem

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.944

天津醫科大學腫瘤醫院婦瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81301895）資助

王珂 kewang_tj@163.com

付欣 專業方向為腫瘤多藥耐藥的相關研究。

E-mail：fxhappy@126.com