胚胎干細胞轉染外源基因教學實驗優化

陳 費， 王敏君， 姚 浩， 劉清桂， 胡以平

(第二軍醫大學 基礎部細胞生物學教研室， 上海 200433)

胚胎干細胞轉染外源基因教學實驗優化

陳 費， 王敏君， 姚 浩， 劉清桂， 胡以平

(第二軍醫大學 基礎部細胞生物學教研室， 上海 200433)

針對胚胎干細胞的培養和外源基因轉染實驗教學過程中，存在學生培養的胚胎干細胞狀態較差、轉染外源基因效率偏低等問題，通過實驗探索，發現通過控制接種滋養層細胞的密度、懸浮轉染代替傳統貼壁轉染的方法，可顯著改善上述問題。該探索不僅優化了轉染方法、提高了教學效果，也為學生培養科研能力奠定了基礎。

胚胎干細胞； 基因轉染； 實驗優化

胚胎干細胞(embryonic stem cells, ES)一般是指由分離自哺乳動物胚泡(blastocyst)的內細胞團所建立的細胞系,它們具有無限增殖能力和多向分化潛能。因此,研究胚胎干細胞無論是對個體生長、發育以及調控的認識,還是其在疾病、制藥和組織再生的應用都有至關重要的作用[1]。在高等院校生命科學和醫學相關專業中,胚胎干細胞的培養和基因改造是兼具重要性和探索性的實驗課之一[2]；同時其作為一項綜合性實驗,在整個過程中學生可學會無菌操作、細胞培養、質粒抽提、細胞轉染以及染色等一系列基本的實驗操作步驟和技能,為后繼的實驗和科學研究奠定基礎[3]。然而由于實驗本身半自主性的特點,容易造成細胞基因改造的結果不穩定,甚至全部陰性的結果,導致學生不自信、對實驗沒有興趣等后果。為此，本文結合常見問題和本校實驗室條件,優化了胚胎干細胞轉染基因的轉染方法,并得到了顯著成效。

1 實驗原理

1.1 小鼠胚胎干細胞的培養

小鼠胚胎干細胞的培養采用文獻[4]報道的培養方法。滋養層為經過絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細胞,培養基為含有谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必須氨基酸、β-巰基乙醇、抗生素以及胎牛血清的DMEM(dulbecco’s modified eagle’s medium),小鼠胚胎干細胞為實驗室自留細胞系。

1.2 小鼠胚胎干細胞的轉染

胚胎干細胞采用脂質體Lipofectamin 2000轉染法[5]。其原理:脂質體表面帶正電荷,通過靜電作用將帶有負電荷的核酸(本實驗用攜帶β-半乳糖苷酶基因的完整質粒)包裹入內,形成脂質體-DNA復合物；與此同時,脂質體也可被帶有負電荷的細胞膜吸附,通過膜流或者胞吞將脂質體-DNA復合物傳遞進入細胞,進而表達外源基因。

1.3 外源基因轉染結果檢測

外源基因轉入胚胎干細胞的檢測采用β-半乳糖苷酶活性檢測法[6]。β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因編碼,本實驗轉入的是大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因),小鼠胚胎干細胞本身不表達,因此可通過酶活性顯色的方法來判斷外源基因是否轉染成功。其顯色采用美國Invitrogen公司的試劑盒來檢測,該試劑盒中含有β-半乳糖苷酶的作用底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal),水解后產物呈藍色,易于顯微鏡檢和觀察。

2 實驗方法

2.1 滋養層的制備

選取第3—第5代狀態較好的小鼠胚胎成纖維細胞,按照適當比例進行傳代；其中實驗組按照1∶4傳代并接種細胞至T25的培養瓶中,對照組按照1∶2傳代并接種細胞至T25的培養瓶中。第二天對細胞進行絲裂霉素C處理4 h后,洗凈并換用正常培養基,放入培養箱等待接種胚胎干細胞[7-8]。

2.2 小鼠胚胎干細胞的接種和轉染

將預混的脂質體和質粒室溫靜置20 min(具體配比參考Invitrogen公司脂質體說明書以及文獻[9])。

實驗組:接種胚胎干細胞的同時,加入脂質體-質粒預混液,補入培養基后混勻,放入培養箱,6 h后換液。

對照組:接種胚胎干細胞,于第二天細胞貼壁后加入脂質體-質粒預混液,補入培養基后混勻,放入培養箱,6 h后換液[10]。

2.3 外源基因的表達檢測

轉染24 h后,可對細胞進行外源基因的檢測。染色使用Invitrogen公司的β-gal Staining Kit,詳細步驟參考相關說明書和文獻[11]。

3 實驗結果

3.1 50%～70%匯合度的滋養層細胞更利于胚胎干細胞的生長

小鼠胚胎干細胞分別接種于不同匯合度的滋養層細胞。其中實驗組滋養層細胞為1∶4傳代獲得,接種胚胎干細胞時細胞匯合度約為60%；對照組滋養層細胞為1∶2傳代獲得,接種時細胞匯合度>95%,細胞近乎長滿。兩組對比可發現,實驗組的較低匯合度滋養層細胞,胚胎干細胞克隆外周光亮,克隆立體感強,相同培養時間克隆數更多,克隆更大更為飽滿，見圖1；對照組滋養層細胞已接近長滿,干細胞克隆相對較小,克隆數也相對較少，見圖2。由此發現,滋養層的匯合度對胚胎干細胞的生長狀態的影響很關鍵,同樣條件下,50%～70%匯合度滋養層細胞比長滿的滋養層細胞更利于胚胎干細胞的生長。

圖1 實驗組滋養層細胞在60%匯合度時小鼠胚胎干細胞生長狀態光學顯微鏡照片(100倍,箭頭指示克隆)

圖2 對照組滋養層細胞在>95%匯合度時小鼠胚胎干細胞生長狀態光學顯微鏡照片(100倍,箭頭指示克隆)

3.2 懸浮轉染法可顯著提高胚胎干細胞轉染效率

轉染后的細胞經染色和顯微鏡觀察,其中藍色的顆粒狀沉淀(見圖3和圖4)為外源轉入基因的表達顯色。通過比較和統計可發現,懸浮狀態下轉染胚胎干細胞的效率要明顯高于貼壁時的效率；轉染效率實驗組為81.5%±4.3%(見圖3)；對照組為26.7%±5.6%(見圖4)。因此,懸浮轉染法可顯著提高胚胎干細胞的轉染效率。

圖3 實驗組小鼠胚胎干細胞轉染外源基因β-半乳糖苷酶底物顯色光學顯微鏡照片(100倍,箭頭指示陽性)

圖4 對照組小鼠胚胎干細胞轉染外源基因β-半乳糖苷酶底物顯色光學顯微鏡照片(100倍,箭頭指示陽性)

4 討論與總結

本實驗的改進,是前期教學探索的成果。在探索過程中,積極發揮了學生的作用，讓學生與教師一起發現問題，并在開放實驗中共同解決問題。當然,本實驗的改進也只是其中一個方面,整個實驗過程連續而復雜,還有很多值得細究和考慮的因素。比如,用來制備滋養層細胞時小鼠胚胎成纖維細胞的質量,外源質粒本身的特點,以及質粒和脂質體配比等其他原因,都是將來值得師生共同探索的著手點。

基礎實驗操作是生命科學以及醫學類相關專業本科生培養過程中必備的技能之一。通過實驗教學,不僅可以使學生掌握動手能力,讓學生體驗親身驗證所學到的理論知識,更重要的是通過實驗來培養和開拓學生的思維能力[12]。胚胎干細胞的培養與基因改造是經典和重要的基礎實驗,通過學生的學習和反饋能發現問題并改進,鍛煉學生操作技能的同時也培養了學生的科研思維[13],為學生將來的學習奠定基礎。

References)

[1] Nishikawa S, Jakt L M, Era T. Embryonic stem-cell culture as a tool for developmental cell biology [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007,8(6):502-507.

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[3] 王敏君,陳費,劉長城,等. 細胞工程實驗教學改革的實踐與探討[J]. 基礎醫學教育, 2015,17(3):220-222.

[4] Ko B S, Chang T C, Shyue S K, et al. An efficient transfection method for mouse embryonic stem cells [J]. Gene Ther, 2009,16(1):154-158.

[5] 陳天姬,杜娟,盧光琇. 小鼠胚胎干細胞轉染條件的優化[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版), 2010,38(12):20-24.

[6] 張莉,李慶章,田雷. β-半乳糖苷酶研究進展[J]. 東北農業大學學報, 2009,40(7):128-131.

[7] 黃林,莫曾南,覃敏. 昆明小鼠胚胎干細胞滋養層制備條件的實驗研究[J]. 現代生物醫學進展, 2010(1):62-65.

[8] 周結學,劉東,鄭克立，等.鼠胚成纖維細胞的培養條件及滋養層制備[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2008,12(34):6607-6611.

[9] Silver D L. A carboxyl-terminal PDZ-interacting domain of scavenger receptor B, type I is essential for cell surface expression in liver [J]. 2002,277(37):34042-34047.

[10] 陳紅,錢坤,張蘇明. 不同轉染方法及GFP表達載體對小鼠胚胎干細胞轉染效率的比較[J]. 華中科技大學學報(醫學版),2006,35(4):536-537.

[11] Ghanekar A, Mendicino M, Liu H, et al. Endothelial induction of fgl2 contributes to thrombosis during acute vascular xenograft rejection [J]. J Immunol, 2004,172:5693-5701.

[12] 黃衛鋒,盛德喬,張忠壽,等.在醫學細胞生物學實驗教學中培養學生創新能力的幾點建議[J]. 教育教學論壇,2013(32):123-124.

[13] 張偉. 細胞生物學實驗教學中學生科研能力培養的措施研究[J]. 高等理科教育, 2012(1):130-133.

Optimization of teaching experiment on transfecting exogenous gene into embryonic stem cell

Chen Fei, Wang Minjun, Yao Hao, Liu Qinggui, Hu Yiping

(Teaching and Research Section of Cell Biology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Aiming at the problems existing in the experimental teaching of culturing embryonic stem cells and transfecting exogenous gene such as the poor state of embryonic stem cells cultured by the students, the low efficiency of transfecting exogenous gene, etc., and through the experimental exploration, this paper finds that the above-mentioned problems can be significantly improved by the method of controlling the density of inoculation of trophoblast cells and the suspensive transfection instead of the traditional adherent transfection. This exploration not only optimizes the transfecting method and improves the teaching effect, but also lays the foundation for cultivating the students’ scientific research ability.

embryonic stem cells; gene transfection； optimization of experiment

10.16791/j.cnki.sjg.2017.02.014

2016-08-25 修改日期：2016-10-17

國家自然科學基金青年基金項目(31601101)

陳費(1988—)，女，安徽當涂，博士，講師，從事組織干細胞特性鑒定、細胞移植研究以及細胞生物學教學工作

E-mail：twinkky@163.com

胡以平(1954—)，男，四川射洪，博士，教授，研究方向為肝臟干細胞.

E-mail：yphu@smmu.edu.cn

Q813；G642.423

B

1002-4956(2017)2-0050-03