羽絨中亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌熒光PCR檢測方法研究

何永盛+林霖+賴心田+王坤+吳佳輝+陳國培

摘要：現有標準對羽絨服裝產品中亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的檢測存在檢測周期長、結果缺乏確證手段等不足之處，需要建立更為快速準確的檢測方法進行補充和完善。本研究建立了可用于亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌鑒定的實時熒光PCR檢測方法，并對該方法的特異性和檢出限進行了分析驗證，結果顯示建立的方法具有良好的特異性，檢出限為20 CFU/mL。在50批次樣品檢測中，本研究建立的方法與國標檢測方法具有較好的一致性，可以應用于羽絨服裝樣品的日常檢測。

關鍵詞：羽絨；亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌；實時熒光PCR

中圖分類號：TS107 文獻標志碼：A

Research on Fluorescence PCR Method for Detecting Sulfite-reducing Clostridia in Down Products

Abstract： Sulfite-reducing clostridia is an important detection index for down products. Due to long testing period and insufficient accuracy， the existing standard test method should be further complemented and improved. Hence， it is necessary to develop a quick and accurate detection method. In this study， a fluorescence PCR method for detecting sulfite-reducing clostridia was established， and the sensitivity and detection limit of the method were analyzed and verified by subsequent experiments. The experiment results showed that the established method can distinguish sulfite-reducing clostridia from other bacteria effectively， and its detection limit reached 20 CFU/mL. The testing of fifty lots of down products verified that the established method is consistent with national standard test method and it can be applied to routine testing of down products.

Key words： down product； sulfite-reducing clostridia； fluorescence real-time PCR

我國是羽絨及其制品的生產、出口和消費大國，近年來羽絨的安全衛生問題越來越受到人們的關注。微生物衛生指標不合格是制約我國羽絨服裝產品出口的一個重要因素。目前，我國和歐盟的相關標準都對羽絨產品的微生物限量提出了明確的要求。作為羽絨服裝產品檢測中的重要微生物指標之一，亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌對外界環境有極強的耐受能力，高溫滅菌等一般的滅菌方法難以將其殺死，因此在檢測當中往往成為導致羽絨服裝產品不合格的主要污染菌。我國羽絨服裝中針對該菌的檢測多采用國家標準GB/T 14272 — 2011《羽絨服裝》中規定的方法，主要通過測定平板上的黑點狀菌落數目來判定該菌是否超標。這種檢測方法雖然操作簡單，但卻也存在檢測周期過長以及檢測結果缺乏確證手段等不足之處，因此有必要建立更為快速準確的檢測方法對其進行補充和完善。

實時熒光PCR技術操作簡便、靈敏度高、特異性強，已廣泛應用于多種病原微生物的快速檢測當中，然而將其應用于亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌檢測的研究在國內外仍未見報道。本研究擬利用實時熒光PCR技術建立可用于鑒定亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的檢測方法，并將其應用于羽絨產品的實際檢測當中。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

羽絨服裝樣品均由客戶提供。丁酸梭菌（CICC 10390）、巴氏梭菌（CICC 10391）、索氏梭菌（CICC 22950）、雙酶梭菌（CICC 22952）、拜氏梭菌（CICC 22954）、產氣莢膜梭菌（CICC 22949）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 實驗試劑

蛋白胨水、亞硫酸鐵多粘菌素B瓊脂、強化梭菌培養基購自北京陸橋技術有限責任公司；2×premix ExTaq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；實驗中所用引物及探針（表 1）由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物和探針的設計

通過測序以及在數據庫中查找的方式獲得17種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的16SrRNA序列，通過序列比對設計出特異性的引物和探針。各菌種的名稱及其序列來源如表 2 所示，其中丁酸梭菌等 6 個菌種的序列通過自行測序獲得，所用引物為文獻報道的菌種16SrRNA測序引物（表 1），其他菌種序列來源于NCBI數據庫。

1.2.2 菌株基因組DNA的制備

以水煮法制備標準菌株的基因組DNA。對 6 株亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌進行增菌培養，取 1 mL菌液，12 000 r/min離心 5 min，棄上清；加入100 μL去離子水重懸菌體，沸水浴加熱 5 min；12 000 r/min離心 5 min，轉移上清液至新的離心管，-20 ℃條件下保存備用。

1.2.3 熒光PCR檢測體系的建立及結果判定

反應體系為20 μL，其中 2×premix ExTaq為10 μL，引物（Clostridium-Forward和Clostridium-Reverse）各0.2 μmol/L，探針（Clostridium-Probe1和ClostridiumProbe2）各0.1 μmol/L，標準菌株DNA為 2 μL。

反應程序：95 ℃時 1 min；95 ℃時10 s，55 ℃時20 s，72 ℃時34 s，40個循環。

結果判定：Ct值≤35時，可判定結果為陽性；Ct值≥40時，可判定結果為陰性；35

1.2.4 方法特異性檢驗

選取丁酸梭菌等 6 種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌及27種其他細菌，用水煮法提取基因組DNA，使用特異性的引物和探針進行熒光PCR反應，以驗證方法的特異性。

1.2.5 方法檢出限測試

通過前期實驗測試發現雙酶梭菌是羽絨服裝產品中經常被檢出的亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌，因此選取該菌作為方法檢測出限測試的代表菌株。對雙酶梭菌進行增菌培養，離心收集菌體，用生理鹽水重懸至 1 個MCF（麥氏單位），并以此為母液進行梯度稀釋，最低稀釋度為10-8 MCF。以水煮法提取每個稀釋度菌液的DNA，用建立的方法進行熒光PCR檢測，每個稀釋度設置 2 個平行，同時取10-4、10-5、10-6 MCF 3 個稀釋度菌液涂布平板，按GB 4789.2 — 2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》規定方法進行菌落計數。

1.2.6 實際樣品檢測

選取50批次羽絨服裝樣品檢驗方法的實際適用性。取出 3 g樣品至無菌袋中，加入300 mL蛋白胨水，20 ℃恒溫振蕩培養 3 h；轉移10 mL樣液至試管中，75 ℃加熱10 min；吸取 1 mL加熱后的樣液至10 mL強化梭菌培養基中，37 ℃厭氧培養過夜，次日以水煮法制備測試所需的DNA，用設計的特異性引物和探針進行熒光PCR反應，同時把各批次樣品按GB/T 14272 — 2011規定的方法進行檢測，對比 2 種方法的檢測結果。

2 結果

2.1 方法特異性實驗結果

以丁酸梭菌等 6 種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌以及27種其他細菌檢驗方法的特異性，結果表明設計的引物和探針具有良好的特異性，對 6 種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌都能擴增出特異性的曲線，而對其他27種細菌種則沒有非特異擴增，檢測結果如表 3 所示。

2.2 方法檢出限實驗結果（圖 1）

選取10-4、10-5、10-6 MCF 3 個稀釋度菌液涂布平板，按GB 4789.2 — 2010規定的方法進行菌落計數。經計算，濁度為 1 MCF的雙酶梭菌菌液對應的菌落數為2×107 CFU/mL。取每個稀釋度菌液 1 mL，以水煮法提取DNA，使用亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌特異性引物和探針進行熒光PCR反應，擴增結果顯示方法的最低檢測限為20 CFU/mL。

2.3 實際樣品檢測結果

利用建立的熒光PCR檢測方法以及GB/T 14272 —2011中規定的方法對50批次羽絨服裝樣品進行檢測（表4）。結果顯示，本研究建立的方法檢出有 9 批次樣品的亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌含量≥100 CFU/g，而GB/T 14272 — 2011規定的方法則檢出 8 批次樣品的亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌含量超標，2 種方法的檢測結果具有較高的一致性。

3 討論

在針對單一病源微生物進行檢測時，研究人員往往會選擇其特有的毒力基因或抗原基因來設計引物和探針，然而亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌是一類形態各異、營養類型多樣的微生物，尋找它們共有的抗原基因或毒力基因存在較大的難度。由于16SrRNA基因序列長短適中，其結構中既有保守區又有變異區，是較好的生物標志物。因此本研究選擇以此作為靶基因，對17種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的16SrRNA序列進行比對，尋找可用于設計特異性引物和探針的基因位點，建立了可以用于該類細菌鑒定的實時熒光PCR檢測方法。

在50批次羽絨服裝檢測當中，本研究建立的方法與GB/T 14272 — 2011中規定的方法在檢測結果上具有較好的一致性，僅 1 個批次樣品檢測結果存在差異。這可能是由于本研究采用的方法經過增菌培養，而且熒光PCR檢測方法又具有極高的靈敏度，從而在一定程度上提高了該類細菌的檢出率。GB/T 14272 — 2011采用的檢測方法僅微物生培養就需要耗費48 h，而本研究建立的熒光PCR檢測方法可以有效縮短檢測周期，更能適應大批量樣品在檢測時效性方面的需求。另外，微生物檢測的最終確證往往需要進行一系列的生化實驗，而國家標準中采用的檢測方法只是簡單地通過菌落的形態和顏色來進行判別，缺乏進一步確證的方法，因此本研究建立的方法也可以作為輔助國標檢測方法進行結果確證的一個有效手段。

參考文獻（略）