人體體液多肽組質譜分析方法優化

高 璐，谷 巖，陳 峰

人體體液多肽組質譜分析方法優化

高 璐，谷 巖，陳 峰

人體體液中多肽組成分近年來獲得越來越多的關注。 不同體液作為不同器官、細胞在生理或病理狀態下的分泌產物，對其成分特定改變的監測具有無創性、早期、敏感特異地預測人體健康狀態、疾病變化、治療療效、藥物毒性等體內變化方面的潛力。 而體液成分多而復雜，體液系統易受干擾，富集、提取分離出相對分子質量整體較低的多肽組成分并進行特定多肽成分的準確計量非常重要而具有挑戰性。目前對人體體液多肽組成分的研究多采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法。 對此方法的實驗偏差進行分析、提出改進方法，可以提高人體體液多肽組成分分析的準確性。應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法對人體體液多肽組成分進行質譜分析是人體健康狀況臨床檢查的新思路，其中特定多肽組成分有潛力成為監測人體相關部位健康狀況的生物標志物。

體液；多肽組；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法；偏差；優化

人體體液多肽組成分的準確分析，特定多肽成分的準確計量很有希望幫助體液多肽組成分監測成為人體內病理等許多變化的新方法。應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 法對人體體液中多肽組成分進行質譜分析是人體相關部位健康狀況臨床檢查的新思路[1-4，7-13]，體液中特定多肽組成分有潛力成為監測人體健康狀況的生物標志物[10-32]，也必將成為今后的研究熱點之一。 現將人體體液多肽組成分 MALDITOF MS 法分析實驗偏差及操作優化方面的研究進行綜述。

1 MALDI-TOF MS 法實驗偏差

偏差主要來源于樣本外部及樣本內部2個方面。 樣本外部偏差因素主要由樣本蛋白/多肽提取，樣本保存、離心分離、凍融，樣本收集時機，基質液種類選擇、準備，實驗儀器性能等方面的偏差導致產生；而樣本內部偏差因素主要是樣本受血液及白細胞干擾，樣本來源個體的年齡及性別差異等方面的偏差導致產生。

1.1 外部偏差

1.1.1 樣本蛋白 /多肽提取 3 名健康個體[1]，上午 10 時(餐后至少 2 h)取等量唾液入唾液收集管，每毫升唾液中加入 10 μL 苯甲基磺酰氟 (0.1 mol/ L) 、1 μL 胃蛋白酶抑制劑(1 mmol/L) 、20 μL 蛋白酶抑制因子混合物(P2714)，均購自美國 Sigma 公司；之后樣本分為離心組與非離心組 2 組，每組各300 μL 初始量，各組內再等分試樣分別以有機溶劑沉淀法、硫酸銨沉淀法、酸沉淀法進行樣本沉淀；部分條件處理組加以超濾步驟，之后的試樣等分、固相萃取、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。質譜分析顯示對于蛋白組成分的獲取:①離心組以酸沉淀提取較未以酸沉淀提取組蛋白獲取量高，乙腈、胍、硫酸銨處理組蛋白獲取率較低；②所有提取方法組中非離心組均比離心組蛋白獲取量高，尤其是乙醇組與丙酮組。 三氟乙酸組與乙腈/超濾組中離心組與非離心組蛋白獲取量相似。 對于多肽組成分的獲取，除乙腈組、乙醇組、丙酮組外，其他所有組中離心前進行提取步驟者多肽組成分獲取量高，其中碳酸氫銨/超濾組結果最佳。

1.1.2 樣本凍融周期、保存條件 獲取條件相同的腦脊液樣本[2]進行 3 組實驗，第 1 組:實驗樣本分別于 4、21 ℃ 分別培養 0、1、3、6、24、48、72 h；第 2 組:樣本收集后分別于-80、-196 ℃條件下保存 4 周；第3 組:樣本保存過程中分別經凍融周期 1、2、3 次。之后的試樣等分、固相萃取、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。質譜分析顯示，4 ℃ 培養樣本可穩定保存 72 h 無降解；而 21 ℃培養樣本 24 h 后即出現多肽組成分差異(信噪比改變)，48 h 后差異更加明顯。 -80、-196 ℃ 條件下樣本保存，質譜信號強度結果未觀察到差異有統計學意義。樣本經凍融周期3次較1次相關信號少量改變，可分辨質譜信號少量減少。

1.1.3 樣本收集時機 樣本(尿液)[3]分別來自一次晨尿、二次晨尿，之后的樣本保存、離心分離、試樣等分、固相萃取、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。 質譜分析顯示，一次晨尿與二次晨尿樣本質譜信號存在顯著不一致，存在部分質荷比信號強度差異有統計學意義。唾液樣本的質譜分析實驗相似，樣本收集時機的不同可能導致樣本成分的顯著改變，進而增加實驗結果的偏差。

1.1.4 基質液的種類及準備方法 實驗樣本為標準樣本(多肽/蛋白混合物)及條件相同的人血清樣本[4]，各分 4 組實驗，分別使用 α-氰基-4-羥基肉桂酸( α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA) 、芥子酸(sinapinic acid， SA) 、 龍膽 酸 (2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB)、2，5-二羥基苯乙酮(2，5-dihydroxyacetophenone，DHAP)4 種基質，均為德國 Merck 公司產品；每組內每種基質分別采用晾干后點樣法(drieddroplet， DD)[5]、 樣 本 /洗 樣 (sample/wash method，SM)[6]2 種基質準備方法。 之后的試樣等分、固相萃取、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。 質譜分析顯示:①DD 法于 4 種基質中都獲得更多同質結晶型，質譜結果更優。 ②SM 法實驗結果整體較 DD 法差，可重復性、再現性、分辨率、信噪比均較低，背景干擾較大，檢測能力較低。 ③從整體實驗結果數據分析來看，CHCA 作為基質實驗結果最差。 就可重復性和再現性而言，SA基質結合 DD 法(SA/DD)實驗結果最穩定。 ④DHB/ DD法實驗結果良好。 此結果與之前研究結果不符，原因可能在于評價標準是背景干擾的大小而非峰值數量的多少。⑤從整體實驗結果數據分析來看，DHAP/DD 法實驗結果最優(樣本為人血清時)，其使用的限制條件在于準備步驟較復雜。

1.1.5 實驗儀器性能 對實驗儀器性能的分析主要在于儀器的質量準確性及批內、批間重復性[2]。 利用相對峰強存在 10 種特征信號的腦脊液樣本，分別采用疏水作用色譜 C8 磁珠( 德國 Autoflex Bruker 公司) ，弱陽離子交換磁珠(MB-weak cation exchange，MB-WCX，德國 Autoflex Bruker 公司) 及銅離子固相金屬離子親和色譜磁珠( 德國 Autoflex Bruker 公司)進行實驗，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。 質譜分析顯示:應用不同磁珠，測得信號數量差異無統計學意義；批內再現性、批間可重復性越好(即批內、批間變異系數越小)，信噪比越大，即質譜分析結果越優。

1.2 內部偏差

1.2.1 樣本受血液及白細胞干擾 相同條件的人腦脊液樣本[2，17]分組實驗，分別加入不同量血液或白細胞，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。質譜分析結果與未污染樣本的結果比較顯示:①質核比1 000 ～ 10 000，血紅蛋白最高樣本 (155 μmol/ L)只出現 25 個峰值，與未加入血液樣本質譜數據比較 89 個峰值未出現； ②血紅蛋白濃度 0.075 μmol/L 以下質譜結果差異無統計學意義，加入血液對質譜結果差異無統計學意義；③經過離心分離，白細胞污染對質譜結果差異無統計學意義。

1.2.2 樣本來源個體的年齡及性別差異 相同條件的 123 份人血清樣本[7]被分為 A(＜30 歲)、B(30 ～50 歲)、C(＞50 歲)3 組及男性、女性 2 組，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI 板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。質譜分析顯示無監督集群圖示，＜30 歲與≥30 歲的質譜數據分散于2個集群中，表明其質譜分析結果差異有統計學意義；男性、女性 2 組質譜數據結果差異無統計學意義。

2 操作優化

對 MALDI-TOF MS 法的部分實驗操作進行優化可減少實驗偏差對實驗結果的影響，從而提高質譜分析結果的準確性。 目前，已有的對實驗操作優化的研究方面包括樣本高豐度蛋白去除、樣本凝固時間及溫度選擇、凍融周期的控制、樣本裝液量(磁珠樣本量比)、樣本基質液準備、MALDI靶板準備、激光照射能量的選擇等。

2.1 樣本高豐度蛋白去除 相同條件人唾液樣本[8]，其中高豐度蛋白主要包括唾液 α-淀粉酶、白蛋白、免疫球蛋白，高豐度蛋白掩蓋低豐度蛋白的質譜監測信號。 樣本收集后:①對白蛋白、IgG 進行去除、捕獲、洗脫(SwellGelò Blue Kit，ProteoPrepò Immunoaffinity Albumin and IgG Depletion Kit) ；②對唾液α-淀粉酶進行親和去除、捕獲、洗脫(淀粉酶去除裝置，臨時專利號 60915204)；③對樣本中總蛋白濃度進行粗測( 蛋白質定量試劑，美國 Bio-Rad Bradford公司)。 之后樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。 質譜分析顯示，去除高豐度蛋白可通過去除高豐度蛋白對低豐度蛋白信號的覆蓋、掩蓋以發現更多低豐度蛋白成分信號，實驗結果更準確。

2.2 樣本凝固時間及溫度選擇 相同條件的人血清樣本[7，9]，血清分離出血漿步驟分組實驗，等分樣本為 3 個溫度條件組，分別于 4、20、37 ℃ 條件下，每組再等分樣本為 4 組分別凝固 0.5、1、2、24 h，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。質譜分析顯示:①20 ℃ 時前 3 組峰值數量差異無統計學意義，而 24 h 組峰值數量最少。 而主成分分析顯示 20℃條件 4 組成分差異有統計學意義(偏析)，隨凝固時間增加可檢測出新的多肽成分。②質譜信號總強度隨凝固時間增加而增加，質譜分析結果轉優，而若凝固過程在質譜分析前一天進行，則質譜信號總強度顯著減小，質譜分析結果較差。 ③20 ℃條件較 4、37 ℃條件所獲峰值數量及質譜信號總強度更高，實驗結果更優。主成分分析顯示不同溫度成分差異有統計學意義(偏析)。

2.3 凍融周期的控制 相同條件的人血清樣本[7]，樣本保存過程中經凍融周期 0、1、2、4 次，之后離心分離、試樣等分、MALDI板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。 質譜分析顯示，質譜信號峰值數量及總強度均隨凍融周期增加而減小；主成分分析顯示 0次組與其他 3組間成分差異有統計學意義(偏析)。 樣本保存過程中經凍融周期次數越少，質譜分析結果越優。

2.4 樣本裝液量(磁珠樣本量比) 相同條件的人血清樣本[7]分 4 組進行實驗，每組等量陰陽離子交換磁珠 10 μL，樣本量分別為 3、5、8、10 μL，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI 板測定位點、質譜采集步驟各組樣本實驗條件均相同。質譜分析顯示:①不同樣本量組質譜峰值數量差異無統計學意義；②不同樣本量組質譜信號總強度有差異，8 μL組結果最優；③主成分分析顯示 4組間成分差異無統計學意義( 偏析) 。 8 μL 血清達到 10 μL 磁珠的最高承載能力；10 μL 血清對于 10 μL 磁珠過飽和，可能導致一些多肽成分由于多肽結合位點有限產生競爭而結合能力降低，從而致質譜分析結果變差。唾液樣本的質譜分析實驗相似，合適的磁珠樣本量比可最大限度充分利用磁珠承載能力，優化質譜分析結果。

2.5 基質液準備 因質譜實驗所用有機基質溶液中包含不穩定成分，易快速揮發[9]，應每日新鮮配制基質液，現配現用，當天基質液應封閉處理并避光保存。

2.6 MALDI靶板準備 ①環境相對濕度應是 30%～60%，溫度 18 ～ 25 ℃[9]，結晶步驟中避免靶板受空調直吹；②測定位點步驟避免滴樣出現氣泡[9]；③洗脫液位點需完全干燥后再滴入基質液，但為減少氧化，應避免干燥后至滴入基質液非操作時間[9]。

2.7 照射激光能量選擇 范圍內適度調整，照射激光能量越低，質譜信號的分辨率越高[9]。

3 操作優化流程

目前文獻研究僅有對人血清樣本的 MALDI-TOF MS 法操作優化后流程[7]，尚無包括唾液在內的其他人體體液樣本的操作優化流程(表 1)。

表1 人體體液樣本的操作優化流程

當然，優化流程的方法不是唯一的，實驗步驟的具體流程也不是唯一的。 在正式實驗的過程中，研究者還需根據實驗室溫度、濕度、質譜儀性能、樣本特點等客觀條件適當調整實驗步驟中各項條件的具體細節，以使實驗條件對于實驗結果的偏差及影響盡量減小，實驗結果更為準確。 如樣本與磁珠比例，不同實驗室進行實驗可能會因磁珠批號等存在差異而使最適樣本磁珠比例有所改變，研究者可進行預實驗以摸清實驗條件，確定個性化的最優操作細節。

4 結論

作者對人體體液多肽組成分應用 MALDI-TOF MS法進行質譜成分分析實驗中可能影響實驗結果的偏差因素及部分實驗操作方法的改進優化進行總結。 發現影響質譜分析結果的實驗外部、內部偏差因素，對可改進的實驗操作進行優化，可提高人唾液中多肽組成分質譜分析的準確性。 應用 MALDITOF MS 法對人體體液多肽組成分進行質譜分析是人體健康狀況臨床檢查的新思路，其中特定多肽組成分有潛力成為監測人體相關部位健康狀況的生物標志物。 對 MALDI-TOF MS 法實驗步驟及操作細節的偏差、優化考量及研究證實是今后研究需重點關注的方面。

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Recent research on optimized mass spectrum analysis of human body fluids peptidome

GAO Lu1，2， GU Yan1，2， CHEN Feng1，3
(1.Beijing Oral Digital Medical Key Laboratory， National Oral Digital Medical Technology and Materials Engineering Laboratory， Beijing 100081， China； 2.Department of Orthodontic，Peking University Hospital of Stomatology， Beijing 100081， China； 3.Central Laboratory，Peking University Hospital of Stomatology， Beijing 100081， China)

Peptidome composition of human body fluid has gained more and more attention. Different human body fluids are excreta or secreta of different organs or cells in physiological or pathological status.By monitoring specific changes of peptidome composition in human body fluids， we can potentially be able to predict human health status， development of diseasess， curative effects of treatments and pharmaceutical toxicity and so on noninvasively early， sensitively and specifically. However， compositions of human body fluids are complicated， the body fluid systems are vulnerable to many factors， so it’ s a big challenge to concentrate， extract and separate peptidome composition which are of low molecular weight and measure specific peptidome composition accurately.Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)method is widely used in researches of peptidome composition of human body fluids at present.Analysis of deviation in experiments and proposing of improved operation can increase accuracy when analyzing peptidome composition in human fluids.Analysing peptidome of human fluids by MALDI-TOF MS method is a new thought of examining human physical conditions clinically.Specific peptidome compositions in human fluids have the potential to be new biomarkers to monitor human physical condition of related body parts.

Body fluid； Peptidome； Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)method； Deviation； Optimize

Q592；Q516

A

2095-3097(2017)01-0060-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.016

2016-10-17 本文編輯:徐海琴)

100081 北京，口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室，口腔數字醫學北京市重點實驗室(高 璐，谷 巖，陳 峰)；100081 北京，北京大學口腔醫院正畸科(高 璐，谷 巖)，中心實驗室(陳 峰)

谷 巖，E-mail:guyan96＠126.com；陳 峰，E-mail:molec ulecf＠gmail.com