脂氧素 A4對缺氧狀態下人肝癌細胞增殖的影響

苗 爍，王素梅，程 雪，李堯豐，馬明洋，李 鋼，吳 萍

脂氧素 A4對缺氧狀態下人肝癌細胞增殖的影響

苗 爍，王素梅，程 雪，李堯豐，馬明洋，李 鋼，吳 萍

目的探討缺氧環境下脂氧素 A4(lipoxin A4，LXA4) 對肝癌細胞增殖的影響。方法采用小鼠肝癌細胞 H22 接種構建小鼠肝癌皮下移植瘤模型，觀察 LXA4對腫瘤生長的影響。 采用免疫組織化學法檢測細胞增殖核抗原 Ki-67 和缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α) 表達。 四甲基偶氮唑鹽比色法檢測細胞增殖水平。結果在接種肝癌細胞 H22 的 7～ 15 d，小鼠皮下可見清晰腫瘤包塊生長；在各相應時間點，給予 LXA4的小鼠腫瘤體積均明顯縮小(P＜0.05)，同時明顯降低了腫瘤組織內部 Ki-67 和 HIF-1α 表達。 體外培養發現 200 nmol/L LXA4可明顯抑制缺氧條件下人肝癌細胞 HepG2 的增殖。結論LXA4能抑制缺氧條件下肝癌細胞的增殖。

脂氧素 A4；肝細胞癌；缺氧；增殖

肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC) 是全球范圍內最常見的腫瘤之一，也是病死率第 3的惡性腫瘤[1]。 我國是 HCC 的高發地區，新增和死亡HCC 病例約占全世界的 50%[2]。 目前，外科手術切除仍是 HCC 首選的治療方法，遺憾的是 HCC 起病隱匿、病情進展迅速，大多數患者確診時已處于中晚期，不適宜手術，且對常規化療藥物不敏感。

由于氧氣的彌散距離僅為 100 μm，快速增長的腫瘤組織往往處于氧供不足的狀態，這使得缺氧成為實體腫瘤的重要特征之一[3]。 腫瘤細胞對低氧的適應性變化是其得以生存的關鍵，同時缺氧對腫瘤組織的增殖、侵襲、轉移、血管生成等各方面也起到了調控作用[4]。

以往的實驗發現，機體重要的促炎癥緩解介質——脂氧素 A4(lipoxin A4，LXA4) 的結構類似物能抑制肝癌細胞 H22 皮下移植肝癌小鼠的腫瘤生長、血管內皮生長因子的表達以及血管的新生[5]。為進一步探討 LXA4對缺氧狀態下肝癌細胞增殖的影響，本研究采用整體模型和缺氧培養的人肝癌細胞 HepG2，觀察 LXA4對肝癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性清潔級 BALB/c 小鼠 24 只，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供[SCXK-(鄂)-2016-0009]，5 ～ 6 周齡，18 ～ 22 g，置于室溫分籠飼養，均自由進食、飲水，光照明暗交替 12 h/d。 所有動物實驗操作均嚴格遵守華中科技大學同濟醫學院實驗動物倫理委員會的相關規定。

1.1.2 細胞 小鼠肝癌細胞 H22 和人肝癌細胞HepG2 購自中國典型培養物保藏中心。

1.1.3 主要試劑 達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium， DMEM) 高 糖培養基(美國 HyClone 公司)；胎牛血清(杭州四季青公司) ；抗生素(100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素)、二甲基亞砜、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、四甲基偶氮唑鹽比色[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT] 及 羥 基 熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂( 美國 Sigma 公司)；LXA4(美國 Cayman 公司)；兔抗人 /小鼠細胞增殖核抗原 Ki-67 抗體( 美國 Santa Cruz 公司) ；兔抗人 /小鼠缺 氧 誘 導 因 子-1α (hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)抗體、小鼠抗人 β-actin 抗體、辣根過氧化物酶標志山羊抗兔/小鼠 IgG(美國 Abcam 公司)；信使RNA(messenge RNA，mRNA) 引物(上海生物工程有限公司) ；2 × 聚 合 酶 鏈 反 應 (polymerase chain reaction，PCR) 混合液( 美國 Invitrogen 公司) ；第一鏈互補 DNA 合成試劑盒(日本 TOYOBO 公司)；總蛋白提取試劑盒( 加拿大 Fermentas 公司) ；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA) 蛋白分析試劑盒及電化學發光(electrochemical luminescence，ECL) 試劑盒( 美國 Pierce 公司) ；蛋白質免疫印跡(Western Blot，WB)凝膠試劑盒(美國 Bio-Rad 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝癌皮下移植瘤模型的建立和分組按照本課題組已建立 的 方 法[5]， 將 腹水中生長 7 d的 H22 細胞置于磷酸鹽緩沖溶液 (phosphate buffer saline，PBS) 中，取 0.2 mL 懸液(1×106/mL) 接種于BALB/c 小鼠的右腋皮下，隔天測量小鼠腫瘤大小，14 d 后取腫瘤組織。 24 只小鼠隨機分為模型組和給藥組，給藥組隔天腹腔注射溶于 10%乙醇中的LXA4(1 μg/kg) ，模型組給予等量的 10%乙醇。

1.2.2 腫瘤大小測量 每日用游標卡尺測量腫瘤最大長徑(long diameter，L) 及寬徑(width diameter，W)，計算腫瘤體積(volume，V)[5]，V(mm)=LW2/2。

1.2.3 免疫組織化學檢測 HIF-1α 分離的腫瘤組織進行 10%甲醛固定、石蠟包埋切片。 然后常規脫蠟至水，0.3%H2O2室溫孵育 10 min，再于微波抗原修復液中進行微波修復 20 min，滴加正常山羊血清封閉液、室溫 20 min。 1 ∶500 稀釋的抗 HIF-1α 和 1 ∶1 000稀釋的抗 Ki-67 一抗，4 ℃ 過夜，PBS 洗 2 次，每次 5 min； 滴 加 辣 根 過 氧 化 物 酶 標 志 的 二 抗 30 μL，室溫靜置 1 h，PBS 洗 2 次，每次 5 min；滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫 37 ℃ 孵育 30 min，PBS洗 2次，二氨基聯苯胺顯色。 陽性表達為細胞膜或細胞質出現棕黃色顆粒。 采用半定量結果判斷，每張切片隨機觀察5個高倍鏡視野，分別對細胞進行染色強度和百分比給予評分，陽性細胞百分比＜5%為 0 分、5%～25%為 1 分、26%～50%為 2 分、51% ～75%為 3 分、＞75%為 4 分，陽性著色強度無色為 0分、淡黃色為 1 分、棕黃色為 2 分、棕褐色為 3 分，將陽性細胞百分比與陽性著色強度相乘為等級即0分為陰性(-)、1～4 分為弱陽性(＋)、5～8 分為陽性(＋＋)、9～12 分為強陽性(＋＋＋)。

1.2.4 細胞培養 將人肝癌細胞 HepG2 置于含10%胎牛血清和 1%青霉素-鏈霉素混合液的 DMEM高糖培養基中，然后在 37 ℃、5%CO2培養箱中，每隔 24 ～ 48 h 定期觀察細胞狀態并換液，必要時以 1∶2 或 1∶3 比例傳代，以維持細胞的良好生長狀態。細胞置于 1%O2、94%N2及 5%CO2混合缺氧氣體中培養。

1.2.5 MTT 法檢測細胞增殖能力 收集對數期HepG2 細胞，于 96 孔板中每孔加入 100 μL 含細胞培養基，使細胞密度為 5×103個/孔；貼壁后換用無血清培養基，繼續培養 24 h，然后置于缺氧培養箱，分為對照組(1%O2) 和 LXA4處理組(1%O2＋200 nmol/L LXA4)， 每組、 每 個時 間 點 各 5 孔， 分 別 于24、48、72 h 停止實驗。 棄去培養液，用 PBS 洗 2遍。 每孔加入 90 μL DMEM 和 10 μL MTT 溶液，使其終質量濃度為 0.5 mg/mL，培養 4 h；棄上清，每孔加入 75 μL 二甲基亞砜，低速振搖 10 ～ 15 min 使結晶物充分溶解。 測量各孔的光密度值(492 nm)。

1.3 統計學處理 應用 Graphpad Prism 軟件，腫瘤大小及細胞增殖率以均數±標準差表示，2 組間均數采用 t檢驗；免疫組織化學評分以中位數±標準差表示，2 組間均數采用 Wilcoxon 秩和檢驗，P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 荷瘤小鼠的皮下腫瘤生長 在接種 H22 細胞的 7 ～ 15 d，小鼠皮下可見清晰腫瘤包塊生長，邊界清晰；在各相應時間點，LXA4給藥組的 V 均明顯小于對照組(P＜0.05，圖 1)。

圖1 荷瘤小鼠的皮下腫瘤生長

2.2 荷瘤小鼠肝癌組織內 Ki-67 及 HIF-1α 的表達鏡下觀察可見模型組腫瘤組織內 Ki-67 和 HIF-1a均呈強陽性，給藥組小鼠腫瘤組織表達均下降。 Ki-67 在模型組和給藥組的評分分別為(6±1.9)分和(4±2.2) 分，差異有統計學意義(P=0.027 6) ；HIF-1α在模型組和給藥組的評分分別為(6±1.9) 和(4± 1.7) ，差異有統計學意義(P=0.008 5)。 見圖 2。

圖2 荷瘤小鼠皮下腫瘤組織Ki-67 及 HIF-1α 表達

2.3 HepG2 細胞增殖情況 HepG2 細胞在缺氧條件下增殖率明顯降低(P＜0.05，圖 3)。

圖 3 HepG2 細胞增殖

3 討論

自 1863 年最初觀察到腫瘤組織周圍存在炎性細胞浸潤，其后大量證據無不提示腫瘤與炎癥息息相關[6]。 LX 是花生四烯酸經過脂加氧酶代謝途徑的產物，為體內最重要的抗炎及促炎癥消退脂質，被稱為“炎癥剎車信號”，已被證實與多種疾病的發生密切相關，如風濕性關節炎、哮喘、休克、糖尿病等[7]。 其在腫瘤中的作用引起了越來越多研究人員的重視，如:能觸發腫瘤相關巨噬細胞從 M2 型轉向 M1 型，從而導致腫瘤細胞的凋亡，減慢其發展[8]；介導了南美響尾蛇神經毒素對大鼠乳腺癌移植瘤模型腫瘤生長和血管新生的抑制作用[9]；減弱了胰腺癌細胞的侵襲能力[10]；以往也證實其在離體水平能促進肝癌細胞的凋亡[11]。

LX 受體激動劑 BML-111 是經化學方法合成的LXA4結構類似物，能通過與 LXA4受體結合而模擬其促進炎癥緩解的效應，在動物肝損傷、關節炎和肺損傷模型 中均 發揮 保護 作用[12-15]。 本實 驗發 現其能抑制小鼠肝癌在移植部位的腫瘤生長、減少其內部血管新生，并顯著抑制腫瘤在肺部的轉移[5]。 由于 BML-111 并非體內存在的天然化合物，且僅能與LXA4的幾種受體之一結合，其與內源性 LXA4的作用仍然存在一定差距。 本實驗中，首先采用隔天腹腔注射 LXA4的方法，證實 LXA4具有抑制小鼠肝癌生長的作用，比以往僅注射 BML-111 能更直接、真實地反映體內 LXA4對肝癌生長的影響作用。 當然，本實驗中采用的腹腔注射 LXA4的方法，雖是目前用于小鼠整體實驗的常用給藥手段，但檢測其最終到達腫瘤局部的濃度仍然值得進一步探討。

缺氧是包括肝癌在內的實體瘤的重要內環境特點和固有特征之一[3，16]，那么 LXA4對肝癌的抑制作用與缺氧是否相關呢?HIF-1 是細胞應對缺氧反應的中心環節，其由 HIF-1α 和 HIF-1β 2 個亞基組成，前者在細胞缺氧時含量增高，從轉錄水平調節多種靶基因的表達，激活多種缺氧相關的信號通路[17]。 本實驗中，通過免疫組織化學法，觀察到皮下移植瘤組織中 HIF-1α 呈明顯高表達，而 LXA4給藥組的含量明顯下降。 HIF-1α 是誘導缺氧狀態下血管新生的重要因子之一，而新生的血管又為腫瘤的生長提供了有利條件[18]。 結合以往發現的 BML-111 能減少移植瘤模型中血管的新生的現象[5]，可以證實 LXA4對 HIF-1α 通路的抑制作用。

目前，有關缺氧對腫瘤細胞生長狀態的影響存在不同的結論，雖然大多數細胞在缺氧條件下生長減慢，但是腫瘤的特殊生物學特征，使其對缺氧微環境更容易適應和生存，甚至生長加快[19-20]。 本實驗同時檢測了 HIF-1α 和反應細胞增殖指標 Ki-67 的含量，結果可見兩者在模型組腫瘤中均明顯高表達，而給藥組則均顯著下降。 為進一步觀察 LXA4的作用，將 HepG2 細胞置于 1%的 O2中培養，MTT 法檢測結果可見缺氧 24 ～ 72 h，細胞數目增加，而 LXA4處理組細胞相對單純缺氧對照組增殖率明顯下降。離體水平的實驗更進一步證實了 LXA4對缺氧狀態下肝癌細胞增殖的抑制作用。

總而言之，在本課題組以往證實 BML-1111 能抑制肝癌內部血管生長的基礎上，在整體和離體水平證實 LXA4對缺氧狀態下的肝癌細胞增殖具有抑制作用。

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The effect of lipoxin A4on the proliferation of human hepatocellular carcinoma under hypoxia

MIAO Shuo1， WANG Sumei1， CHENG Xue1， LI Yaofeng1， MA Mingyang2， LI Gang3， WU Ping1
(1.Department of Pathophysiology， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430030， China； 2.Hepatic Surgery Center， Tongji Hospital of Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology， Wuhan Hubei 430030， China； 3.Department of Surgery，Liyuan Hospital， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan Hubei 430077， China)

ObjectiveTo explore the effect of lipoxin A4(LXA4)on the proliferation of human hepatocellular carcinoma(HCC)under hypoxic condition.MethodsEctopic HCC mice model was established by injection H22 cells subcutaneously.Immunohistochemistry assay was applied to detect the protein expression of Ki-67 and hypoxia-inducible factor-1 α (HIF-1α).HepG2 cells were cultured under 1%O2to establish a hypoxic condition.3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)assay was used to measure cell proliferation rate.ResultsIn 7 to 15 days after H22 cell transplantation，the subcutaneous tumor in mice could be observed.At all the time points， the tumor volume of LXA4mice was significantly reduced(P ＜ 0.05).At the same time， LXA4significantly decreased the expression of Ki-67 and HIF-1α inside tumor tissue.In vitro study showed that 200 nmol/L LXA4obviously inhibited HepG2 proliferation under 1%O2.ConclusionLXA4could inhibit the HCC growth under hypoxia.

Lipoxin A4(LXA4) ； Hepatocellular carcinoma(HCC) ； Hypoxia； Proliferation

R735.7；R349.89

A

2095-3097(2017)01-0016-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.004

2017-01-09 本文編輯:徐海琴)

國家自然科學基金面上項目(81272313)

430030，湖北 武漢，華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院病理生理學系(苗 爍，王素梅，程 雪，李堯豐，吳 萍)；430030，湖北 武漢，華中科技大學附屬同濟醫院肝臟外科中心(馬明洋)；430077，湖北 武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院外科(李 鋼)

李 鋼，E-mail:wpingwp＠mails.tjmu.edu.cn

[注 明] 苗 爍，王素梅:為共同第一作者