可溶性白細胞分化抗原 40配體原核表達載體的構建與鑒定

張強，喬錄新，吳 濤，劉東杰，紀 樂，陳德喜，吳 剛

可溶性白細胞分化抗原 40配體原核表達載體的構建與鑒定

張志強，喬錄新，吳 濤，劉東杰，紀 樂，陳德喜，吳 剛

目的構建原 核 表達載體 pGEX-4T 含 人 可溶性 白 細胞分化 抗 原 40 配 體 (soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand，sCD40L) 重組質粒。方法通過反轉錄-聚合酶鏈反應擴增，獲得人 sCD40L 的基因片段；將其連接入 T 載體，用 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷與異丙基-β-D-硫代半乳糖苷篩選陽性克隆，鑒定正確后經 BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切，再與 pGEX-4T 原核表達載體連接，最后經酶切及測序鑒定。結果以L02 細胞的互補 DNA 為模板，擴增出 474 bp 的目的基因；將目的片段與 T 載體連接并進行藍白篩選得到陽性克隆；構建 pGEX-4T-sCD40L 重組質粒，經轉化和篩選獲得重組菌，經酶切、基因測序證實序列正確。結論成功構建 pGEX-4T-sCD40L 原核表達載體，為進一步探討 sCD40L 在肝癌診斷中的作用奠定基礎。

可溶性白細胞分化抗原 40 配體；原核表達載體；融合蛋白

人可溶性白細胞分化抗原 40 配體(soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand， sCD40L) Ⅱ 型跨膜糖蛋白，相對分子質量為 39×103，是腫瘤壞死因子超家族成員之一[1]。 CD40L 有 2 種相對分子質量更小的可溶形式；其中 18×103的 sCD40L 具有生物學活性，可看做是一種可溶性的細胞因子。 研究表明，在存在 CD40 表達的腫瘤細胞中，sCD40L可直接抑制腫瘤細胞的增殖，具有調節腫瘤細胞生長與誘導細胞凋亡的作用[2]。 研究發現，CD40-CD40L 相互作用影響腫瘤細胞遷移，這使 sCD40L在癌癥中的作用獲得廣泛的關注[3]。 在癌癥患者中，sCD40L 更可能來自活化的血小板而不是來自 T細胞[4]。 因此，sCD40L 可以通過誘導血栓形成反應和釋放血管生成相關的細胞因子來影響癌癥的發展和惡化。 CD40 在人類癌癥中的廣泛表達也支持這種配體在癌癥發病機制中的作用[5]。 研究顯示，在患有某些實體瘤和骨髓增生性腫瘤的患者中血清sCD40L 水平升高[6]。 CD40 在肝癌組織中的表達增加，并且肝癌中表達的 CD40 在腫瘤生物學特別是抵抗 Fas和腫瘤壞死因子受體介導的細胞凋亡中發揮重要作用[7]。

肝細胞 癌 (hepatocellular carcinoma， HCC) 是最致命的惡性腫瘤之一，其相關的發病率和病死率受到密切關注?；谏钊雽彶榈母伟┭鍖W診斷，除了甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)，還有扁豆凝集素反應性 AFP、脫-γ-羧基凝血酶原、表達有免疫球蛋白和表皮生長因子、肌醇蛋白聚糖-3、高爾基蛋白 73、白介素-6 和鱗狀細胞癌抗原已作為早期 HCC 檢測的生物標志物被提出[8]。 有文獻報道，sCD40L 作為肝癌早期檢測和肝臟中其他腫瘤性損害的標志物的可靠性作用，肝癌中 sCD40L 作為標志物的優良選擇性高于 AFP[9]。 本研究采用重組 DNA 技術，克隆sCD40L 全長互補 DNA(complementary DNA，cDNA)，采用 pGEX-4T-1 表達載體，表達谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)-sCD40L 融合蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常肝 L02 細胞、pGEX-4T 質粒由包頭醫學院實驗室保存。 大腸桿菌 DH5α、BL21 感受態細胞、PMD18-T 載體、RNA 提取、反轉錄、膠回收、質粒提取試劑盒均購自北京博邁德生物技術有限公司。 限制性內切酶 BamHⅠ和 XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、 T7 DNA 連 接 酶 為 美 國 Fermentas 公 司 產品。 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG) 購自德國 SIGMA 公司。 瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂等化學試劑均購自美國 Oxoid 公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增 提取 L02 細胞總 RNA，利用反轉錄試劑盒將其反轉錄為 cDNA，-20 ℃ 凍存備用。 根據國家生物技術信息中心檢索結果，確定 sCD40L 的編碼區序列，設計引物:上游引物 P1為 5′-CGCGGATCCGGTGATCAGAATCCT-3′；下游引物 P2 為 5′-CCGCTCGAGCAGCCTGCAAGGTGAC-3′。擴增片段大小為 474 bp。

反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR) 的 反 應 體 系 為:2 × PCR 混合液 25 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 2 μL，補充去離子水至總體積為 50 μL。 PCR 擴增條件，94 ℃ 預變性 5 min、94 ℃ 變性 30 s、56 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸 30 s，行 30 個循環；最后 72 ℃ 延伸 5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證 PCR 產物，得到 474 bp 擴增片段。利用凝膠回收試劑盒純化并回收 PCR 產物。

1.2.2 連接 T 載體 將上述純化回收的 PCR 產物與 PMD18-T 載體進行連接，連接產物轉入 DH5α 感受態細胞，使用含氨芐西林( 終質量濃度為 50 mg/ L) 的 Luria-Bertani(LB) 培養基平板 ( 預先用 IPTG與 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷混合液處理) 進行藍白斑篩選，過夜培養后，挑取白色菌落進行擴大培養，取部分菌液用作模板，用上述設計好的引物進行 PCR 鑒定，將 PCR 鑒定正確的菌液送北京博邁德科技發展有限公司測序。

1.2.3 重組質粒 pGEX-4T-sCD40L 的構建 純化測序正確的 DNA 片段，用 BamHⅠ和 XhoⅠ分別雙酶切該目的片段與 pGEX-4T 載體，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證并純化回收，將純化回收的片段用T7 DNA 連接酶進行連接。 反應體系 10×連接緩沖液 1 μL、T7 DNA 連接酶 1 μL、載體 1 μL、目的片段4 μL，補去離子水至 10 μL。 充分混勻后室溫靜置過夜。 次日，將連接產物轉化 DH5α 感受態細胞，將轉化的 DH5α 涂于氨芐西林抗性的 LB 培養板上，37℃培養箱倒置培養過夜。

1.2.4 酶切及測序鑒定重組質粒 挑取數個單克隆，37 ℃ 培養 12 ～ 16 h 后提取質粒，將 BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確的質粒送北京博邁德科技發展有限公司測序。

1.2.5 pGEX-4T-1/sCD40L 在大腸桿菌中的表達以 pGEX-4T-1/sCD40L 質粒轉化到 BL21 大腸桿菌感受態中，挑取單個菌落，接種于 6 mL 含氨芐西林抗性的 LB 培養基，37 ℃ ，200 r/min 過夜培養。 懸液光密度 590 nm 值約為 0.6 時，留取 500 μL 氨芐西林菌液電泳點樣，繼續加 1 mmol/L IPTG 誘導劑，16℃ 繼續培養 14 ～ 16 h，取 500 μL 菌液5 000 r/min 離心 5 min，將沉淀重懸于 40 μL pH 6.8 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中，加入蛋白上樣緩沖液進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)。

2 結果

2.1 RT-PCR 克隆目的片段 以 L02 細胞的 cDNA為模板，用文中設計的引物 P1、P2 進行 PCR，擴增產物經瓊脂糖電泳鑒定，出現片段大小符合預期的單一條帶，1.5%瓊脂糖電泳結果見圖 1。

圖 1 PCR 擴增產物

2.2 目的基因連接 T 載體 目的片段與 T 載體的連接產物轉化后經 PCR 篩選獲得陽性克隆 PMD18-T/sCD40L，測序后經 BLAST 數據庫比對序列正確，無終止密碼子突變(圖 2)。

圖 2 PMD18-T/sCD40L 測序

2.3 pGEX-4T-1/sCD40L 的構建及鑒定 PCR 擴增產物與 pGEX-4T 載體連接，經 BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切鑒定，得到預期大小目的片段。 進一步測序驗證，該序列與 sCD40L 片段完全一致(圖 3)。

圖 3 pGEX-4T-1/sCD40L 質粒鑒定

2.4 GST-sCD40L 融合蛋白表達 經 IPTG 誘導的pGEX-4T-1/sCD40L 工程菌的上清中有相對分子質量為 40×103的蛋白，與預期值相符(圖 4)。

圖 4 GST-sCD40L 融合蛋白表達形式 SDS-PAGE 分析

3 討論

CD40L 以 2 種形式存在，即細胞膜結合的 CD40L (mCD40L) 和 sCD40L。 當 mCD40L 被蛋白水解酶切割時產生 sCD40L，CD40L 主要表達于 CD4＋T 細胞、血小板、單核細胞、巨噬細胞、B 細胞和自然殺傷細胞上。 CD40 最初被鑒定為 B 細胞受體，其是誘導有效適應性免疫應答的關鍵。 證據表明，對腫瘤的免疫主要依賴于 CD40-CD40L 相互作用。 CD40和 CD40L 的連接可以導致 sCD40L 從細胞表面脫落并釋放到體液中。 與 mCD40L 相比，sCD40L 是功能性三聚體，意味著它可以執行類似于膜結合 CD40L的功能，但只有較少的信號傳導強度[10]。 早期研究確定了自身免疫疾病如系統性紅斑狼瘡以及一系列血管疾病(糖尿病、高血壓、外周血管疾病和冠狀動脈疾病) 中血清 sCD40L 的水平升高；在癌癥患者中，肺癌、未分化鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌和結腸癌患者的血清 sCD40L 水平顯著高于健康人[11]。 有文獻報道，sCD40L 在循環分析中也存在潛在的預后應用[12]。 CD40 在肝癌組織中均異常表達，可作為判斷原發性肝細胞癌侵襲轉移及預后的指標，并為原發性肝細胞癌的生物治療提供實驗依據[13]。

肝癌是世界上第5位常見和第3位致命的癌癥，肝細胞癌占肝癌的 90%[14]。 腫瘤標志物的研究對提高原發性肝癌的診斷有相當重要的意義。目前原發性肝癌診斷的標志物主要是 AFP，但是其敏感性不足，多種肝癌標志物的聯合應用檢測可以有效提高診斷的敏感性和特異性。如今人們正在尋找更好的、更具特異性和敏感性的腫瘤標志物[15]。 為了進一步研究 sCD40L 基因的功能，本研究采用基因重組技術在大腸桿菌中表達 sCD40L，利用 pGEX 載體所誘導表達的蛋白在 N 端帶有 GST標簽，方便下一步融合蛋白的純化和抗體的篩選，便于進一步研究 sCD40L 在肝癌早期診斷中的作用。 由于考馬斯亮藍染色鑒定蛋白誘導表達實驗中上樣量較少，實驗結果顯示誘導條帶不明顯，在后續實驗中已經大量提取目標蛋白，并且送公司作為免疫抗原制備出sCD40L 單抗。

[1]Kawashita Y，Deb NJ，Garg MK，et al.An autologous in situ tumor vaccination approach for hepatocellular carcinoma.2.Tumor-specific immunity and cure after radio-inducible suicide gene therapy and systemic CD40-ligand and Flt3-ligand gene therapy in an orthotopic tumor model[J]. Radiat Res，2014，182(2):201-210.

[2]Korniluk A， Kemona H， Dymicka-Piekarska V.Multifunctional CD40L:pro-and anti-neoplastic activity[J].Tumour Biol，2014，35(10):9447-9457.

[3]Tai YT，Podar K，Mitsiades N，et al.CD40 induces human multiple myeloma cell migration via phosphatidylinositol 3-kinase/AKT/NF-κB signaling[J].Blood，2003，101(7): 2762-2769.

[4]Freedman JE.CD40-CD40L and platelet function:beyond hemostasis[J].Circ Res，2003，92(9):944-946.

[5]Sabel MS， Yamada M， Kawaguchi Y， et al.CD40 expression on human lung cancer correlates with metastatic spread[J].Cancer Immunol Immunother， 2000， 49(2): 101-108.

[6]Chung HW，Lim JB.Clinical significance of elevated serum soluble CD40 ligand levels as a diagnostic and prognostic tumor marker for pancreatic ductal adenocarcinoma[J].J Transl Med，2014，12(1):1-9.

[7]Sugimoto K，Shiraki K，Ito T，et al.Expression of functional CD40 in human hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，1999，30(4):920-926.

[8] 金鑫.肝癌早期診斷相關分子標志物研究進展[J].現代醫藥衛生，2015，31(23):3579-3582.

[9]Eltaher SM，El-Gil R，Fouad N，et al.Evaluation of serum levels and significance of soluble CD40 ligand in screening patients with hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma[J].EMHJ，2016，22(8):603-610.

[10]Elgueta R，Benson MJ，de Vries VC，et al.Molecular mechanism and function of CD40/CD40L engagement in the immune system[J].Immunol Rev，2009，229(1):152-172.

[11]Huang J，Jochems C，Talaie T，et al.Elevated serum soluble CD40 ligand in cancer patients may play an immunosuppressive role[J].Blood，2012，120(15):3030-3038.

[12]Schlom J，Jochems C，Gulley JL，et al.The role of soluble CD40L in immunosuppression[J].Oncoimmunology，2013，2(1):275-284.

[13] 孫亞欣，張志超，賈明庫.CD40 與 ICAM-1 在原發性肝細胞癌組織中的表達及臨床意義[J].吉林大學學報:醫學版，2009，35(2):348-351.

[14]Zhu CP， Wang AQ， Zhang HH， et al.Research progress and prospects of markers for liver cancer stem cells[J]. World J Gastroenterol，2015，21(42):12190-12196.

[15] 林健敏，吳岑江，鄭裕明.原發性肝癌腫瘤標志物的研究進展[J].中國癌癥防治雜志，2006，20(1):66-69.

Construction and identification of soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand prokaryotic expression vector

ZHANG Zhiqiang1， QIAO Luxin2， WU Tao1， LIU Dongjie1， JI Le1， CHEN Dexi2， WU Gang1
(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology， Baotou Medical College， Baotou Inner Mongolia 014040， China； 2.Beijing Institute of Liver Diseases， Beijing 100069， China)

ObjectiveTo construct containing human soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand(sCD40L)recombinant plasmid pGEX-4T-sCD40L.MethodsThe gene fragment of human leukocyte sCD40L was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RTPCR).The fragment was ligated into T vector and ligated with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(X-gal)and isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG).The positive clones were screened by IPTG.The positive clones were digested with BamH Ⅰ and Xho Ⅰ， then ligated with pGEX-4T prokaryotic expression vector， and identified by restriction enzyme digestion and sequencing.ResultsThe target DNA fragment of 474 bp was amplified by the complementary DNA(cDNA) of L02 cells.The recombinant plasmid pGEX-4T-sCD40L was constructed by ligating the target fragment with T vector and screening for blue-white.The recombinants were obtained by transformation and screening， and the sequences were confirmed by restriction enzyme digestion and gene sequencing.ConclusionThe prokaryotic expression vector pGEX-4T-sCD40L has been successfully constructed， which lays a foundation for further study on the role of sCD40L in the diagnosis of hepatocellular carcinoma(HCC).

Soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand(sCD40L) ； Prokaryotic expression vector； Fusion protein

R392.11

A

2095-3097(2017)01-0012-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.003

2016-12-19 本文編輯:徐海琴)

國家自然科學基金資助項目(81361120401)；首都衛生發展科研專項項目(首發 2014-1-1151)

014040 內蒙古 包頭，包頭醫學院生物化學與分子生物學教研室(張志強，吳 濤，劉東杰，紀 樂，吳 剛)；100069 北京，北京市肝病研究所(喬錄新，陳德喜)