p—ERK在COPD大鼠肺氣腫形成中的表達研究

漆勇+戴志輝+廖曉斌

摘要：目的 探討在COPD大鼠肺氣腫形成過程中肺組織磷酸化細胞外信號調節激酶（p-ERK）的表達變化。方法 30只大鼠隨機分為對照組、21d組、28d組，每只各10只。采用香煙煙熏聯合氣管內注入脂多糖的方法建立COPD模型。分別于21d、28d用圖像分析系統測定肺泡平均內襯間隔（MLI）、平均肺泡數（MAN），用免疫組化法測定肺組織中p-ERK的表達。結果 MLI、MAN、肺組織p-ERK表達在21d組（70.38±7.14×10-6m，125.64±5.41個/m2，0.245±0.020）、28d組（96.76±9.07×10-6m，91.02±9.22個/m2，0.341±0.038）分別與對照組（47.76±4.27×10-6m，154.61±6.40個/m2，0.120±0.021）相比有顯著性差異（P<0.01）；21d組、28d組MLI與肺組織p-ERK呈正相關（分別r=0.770，P<0.01）；21d組、28d組MAN與肺組織p-ERK呈負相關（分別r=-0.753，P<0.01）。結論 p-ERK在肺組織表達的增高，可能是COPD肺氣腫形成的重要因素之一。

關鍵詞：磷酸化的細胞外信號調節激酶；肺疾病；阻塞性；肺氣腫

肺氣腫是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）重要的病理特征之一，其發病機制不完全明確，與炎癥反應、蛋白酶-抗蛋白酶失衡等密切相關[1]。細胞外信號調節激酶（ertracellular-signal regulated kinase，ERK）屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，是體內多條信號轉導途徑的匯集點[2]，可以介導氧化應激的發生，炎癥細胞、炎性介質的產生以及蛋白酶的增加等。p-ERK作為ERK的活化形式，目前還未見與COPD肺氣腫關系的相關報道。因此，觀察在COPD大鼠肺氣腫形成過程中肺組織p-ERK的表達，可能為防治COPD肺氣腫形成提供新的研究思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 脂多糖（LPS）（菌屬O55：B5），北京博奧森生物技術有限公司；"天下秀"牌香煙（焦油量：11mg，煙氣煙堿量：1.0mg），川渝中煙工業有限責任公司；Rabbit Anti-phospho-ERK1/2（Thr202+Tyr204）antibody（bs-3016R），北京博奧森生物技術有限公司；雄性SD大鼠30只，體重（210±20）g，西南醫科大學實驗動物中心提供；有機玻璃煙熏箱，自制；真彩色醫學圖像分析系統BI-2000，成都泰盟電子有限公司。

1.2方法 選取30只雄性SD大鼠隨機分為三組，對照組：10只，呼吸正常空氣及飼養4w，于第1、15d氣管內注入生理鹽水200μl。28d組參照顧延會[3]的造模方法，在第1、15d經氣管注入200μl LPS（200μg/200μl），其余時間將大鼠放入機玻璃煙熏箱內煙熏天下秀牌香煙，2次/d，30 min/次，香煙12支/次，煙熏至少間隔2 h/次。21d組制備方法同28d組。

1.3肺組織標本處理 分別處死各組大鼠，取左肺下葉，用4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋，切片，分別行HE染色、免疫組化染色。在顯微鏡200倍下觀察HE染色的肺組織切片，隨機選取左、中、右、上、下五個視野進行測量。標記通過各個視野中央"十"字交叉線的肺泡間隔數（Ns），測出十字交叉線的總長度（L），采用L/Ns表示各個視野肺泡平均內襯間隔（MLI），反映肺泡的直徑大小。標記出每個視野內的肺泡數（Na），測出各個視野的面積（S），采用Na/S表示各個視野的平均肺泡數（MAN），反映肺泡的密度改變。檢測免疫組化染色切片的隨機3個視野肺組織p-ERK相對陽性表達強度，計算p-ERK平均吸光度值（A值）。

1.4統計學處理 采用SPSS 17.0統計學分析，數據用均數±標準差（x±s）表示，多組均數采用單因素方差檢驗。Pearson直線相關分析數據相關性，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 由圖1～3可見，對照組（圖1）肺泡結構正常。21d組（圖2）肺泡腔大小不一，少許肺泡壁斷裂，周圍可見部分炎細胞浸潤。28d組（圖3）肺泡壁斷裂、肺泡融合、肺泡腔不規則的擴大，周圍可見大量炎性細胞浸潤。由表1可見，28d組與對照組比較，MLI明顯升高，MAN明顯降低（均P<0.01）；21d組與28d組比較，MLI明顯降低，MAN明顯升高（均P<0.01）。

圖1～3大鼠肺泡病理學改變（HE×200）：對照組（圖1）、21d組（圖2）、28d組（圖3）。

2.2免疫組化結果 由圖4～6可見，p-ERK主要表達在支氣管內皮細胞、平滑肌細胞、肺泡上皮細胞以及肺間質細胞，對照組（圖4）p-ERK呈低表達，21d組（圖5）p-ERK表達較28d組減少，28d組（圖6）p-ERK呈高表達。由表2可見，28d組與對照組比較，p-ERK表達明顯增加（均P<0.01）；21d組與28d組比較，p-ERK表達明顯減低（均P<0.01）。

圖4～6肺組織中p-ERK表達 （免疫組化×200） 對照組（圖4）、21d組（圖5）、干預組（圖6）。

2.3相關性分析21d組、28d組MLI與肺組織p-ERK呈正相關（r=0.770，均P<0.01）；21d組、28d組MAN與肺組織p-ERK呈負相關（r=-0.753均P<0.01）。

3 討論

COPD的發病率、死亡率逐漸升高，與肺組織對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常慢性炎癥反應密切相關。肺氣腫是COPD的重要病理特征，因此，研究肺氣腫形成機制成為了當今醫學領域的熱點。目前發現COPD肺氣腫的發病與炎癥損傷、蛋白酶抗蛋白酶失衡、氧化應激、自身免疫反應等有關，但具體發病機制并不完全明確，涉及信號通路的相關性研究甚少。

ERK家族有5個亞族，包括ERK1-ERK5，ERK1和ERK2是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵激酶，p-ERK作為ERK的活化形式，參與細胞增殖、應激反應、凋亡等調控。活化的ERK可以提高肺內中性粒細胞、白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平[4]，促進肺成纖維細胞對基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、MMP-1、MMP-2的分泌[5-6]，介導氧化應激的發生。本實驗顯示，21d組和28d組MLI、MAN、肺組織p-ERK表達分別與對照組比較，具有統計學意義。21d組、28d組MLI與肺組織p-ERK呈正相關，具有統計學意義，而21d組、28d組MAN與肺組織p-ERK呈負相關，具有統計學意義，說明在COPD肺氣腫形成過程中，p-ERK在肺組織中的表達增高，提示肺組織p-ERK的表達在COPD肺氣腫形成過程中起著重要作用。

綜上所述，p-ERK在肺組織中表達增高，可能是COPD肺氣腫發病機制中重要因素，進一步研究p-ERK在COPD在肺氣腫的作用，可能為防治COPD提供新的研究思路。

參考文獻：

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[3]顧延會，歐陽瑤. 煙熏聯合脂多糖制備大鼠慢性阻塞性肺疾病動物模型[J].重慶醫學，2012，41（13）：1295-1296.

[4]Berman R， Huang C， Jiang D， et al. MUC18 Differentially Regulates Pro-Inflammatory and Anti-Viral Responses in Human Airway Epithelial Cells [J]. J Clin Cell Immunology， 2014， 5（5）：257.

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[6]Asano K， Shikama Y， Shoji N， et al Tiotropium bromide inhibits TGF-beta-induced MMP production from lung fibroblasts by interfering with Smad and MAPK pathways in vitro [J].Int J Chro Obstruct Pulmon Dis， 2010（5）：277-286.

編輯/蔡睿琳